中国药理学与毒理学杂志 2003 年 12 月 ; 17 (6) :451 - 456 Chin J Pharmacol Toxicol 2003 ; Dec 17 (6) :451 - 456
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银杏黄酮山奈酚的体外葡醛酸结合反应
顾少君 , 姚彤炜 3 , 胡 静
- 1
( 浙江大学药学院药物分析与药物代谢研究室 , 浙江 杭州 310031)
和空白组微粒体中的代谢较弱 .在 0. 2 g· - 1 的微 L 粒体蛋白质浓度的孵育液中 ,山奈酚 ( 40 mg· - 1 ) 经 L 45 min 孵 育 后 , 分 别 有 62. 9 % ( DIPH ) , 40. 1 %
(BNF) ,21. 1 % ( PB ) ,23. 7 % ( DEX) 和 18. 0 % ( 空白 组) 的量被代谢 .测得山奈酚在空白对照组 , 和 BNF mol L 1. 05) , ( 9. 41 ± 45) 和 ( 72. 4 ± 08)μ · 2. 3.
DIPH 诱 导 的 微 粒 体 中 的 Km 值 分 别 为 ( 1. 85 ± ; V max
值分别为 ( 2. 45 ±0. 63) , ( 7. 55 ±1. 40 ) 和 ( 25. 2 ± 1. 08)μ · - 1 · - 1 .结论 山奈酚在各种微粒 min mol g 体中被广泛代谢 ;BNF 和 DIPH 葡醛酸转移酶的强 诱导剂可使山奈酚 Ⅱ相葡萄糖醛酸苷结合反应增 强. 关键词 : 山奈酚 ; 葡萄糖醛酸苷结合 ; 微粒体 ; 药 物代谢 ; 色谱法 , 高效液相 中图分类号 : R963 文献标识码 : A
摘要 : 目的 旨在了解银杏黄酮山奈酚代谢的有关 酶系及酶动力学参数 .方法 采用苯巴比妥 ( PB ) , β 地塞米松 (DEX) , 2萘黄酮 (BNF) 和地非三唑 ( DIPH) 诱导 SD 大鼠 ,与未诱导大鼠分别作为体外代谢的 5 种不同酶源 .取山奈酚和鼠肝微粒体 25 ℃下共孵 育 ,HPLC 法测定孵育液中剩余底物浓度 .比较不同 诱导剂处理的鼠肝微粒体对山奈酚代谢的催化活 性 ,以未作任何处理的鼠肝微粒体为空白对照 .结 果 山奈酚在 BNF 和 DIPH 诱导的鼠肝微粒体中有 较强的代谢作用 ,而在 PB , DEX 诱导的鼠肝微粒体 文 章 编 号 : 100023002 ( 2003) 0620451206
研究方向为药物分析和药物代谢研究 .
(0571) 87217203
3
关注 ,已有不少文献 [1～4 ] 报道了银杏黄酮的提取分 离, 定性定量分析和药理作用等 .了解银杏黄酮在 体内的生物转化 , 排泄及代谢产物的生理活性等 ,对 指导临床用药有重要意义 .本实验旨在研究银杏黄 酮的主要成分山奈酚的代谢情况 , 了解其代谢相关 的主要酶系 ,获得代谢酶动力学参数 ,为进一步研究 银杏黄酮的体内外代谢打下实验基础 .
1 材料与方法
1. 1 仪器与试药 FD 10VA 组织匀浆机和 Jouan MR1822 自动高速
lent 1100 型高效液相色谱仪 , G1315B 二极管阵列检
BNF) 为 Sigma 公司产品 .UDPG 溶液的配制 : 称取 A 50 g· - 1的溶液 ( 临用新配) . L 1. 2 色谱条件
UDPG 适量 , 加 pH 7. 5 磷酸盐缓冲液制成浓度为 A
银杏叶提取物具有多种生理活性使其受到广泛
收稿日期 : 2002212210 接受日期 : 2003206211
基金项目 : 浙江省自然科学基金资助项目 (302682)
μ ) ,流动相 :pH 2. 0 磷酸水溶液2四氢呋喃2甲醇2异 m 丙醇 ( 65: : : ) ,流速 0. 5 mL · - 1 ; 检测波长 : 15 10 20 min
380 nm ; 进样量 20 μ . L 1. 3 微粒体制备
作者简介 : 顾少君 ( 1979 - ) , 女 , 杭州人 , 硕士研究生 , 联系作者 E2mail : yaotw @zjuem. zju. edu. cn Tel/ Fax :
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冷冻离心机 ,日本日立公司 ;DKZ21 型电热恒温震荡 水槽 ,上海医用恒温设备厂 ;LC210AT 高效液相色谱 仪系 统 , SPD210AVP 紫 外 检 测 器 , 日 本 岛 津 公 司 ; 司.
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测器 ,HP ChemStations 处理软件 , 安捷伦科技有限公
山奈酚 ( kaempferol ) , 中国药品生 物 制 品 检 验 所 ;地非三唑 ( diphenytriazol , DIPH) 注射液 , 浙江仙
居制药厂 ,三 ( 羟甲基) 氨基甲烷 ,中国医药上海化学 生物试剂站 ; 尿嘧啶二磷酸葡萄糖醛酸 ( UDPG ) , A
Triton X2100 , 苯巴比妥 (phenobarbital , PB) , 地塞米松 ( dexamethasone , DEX ) ,2萘 黄 酮 (β naphthoflavone , β 2
取 Sprague2Dawley 雄性大鼠 , 体重 150 ～ 180 g , 中国科学院上海实验动物中心 ( 二级 , 证书号 003) ,
HS2000 色谱处理软件 ,英谱科技开发有限公司 ;Agi2
分析柱 : Platinum EPS2C18 ( 4. 6 mm × 250 mm ,5
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分为 DEX ,BNF ,PB ,DIPH 和空白对照组 , 每组 2 ～ 3 只 ,共 3 批 .PB 溶于生理盐水 ,80 mg· - 1 · - 1 ,ip , kg d 3 d ;DIPH 油注射液 ,30 mg· - 1· - 1 ,ip ,4 d ;DEX 混 kg d 悬于水 ,100 mg· - 1 · - 1 ,ig ,3 d ;BNF 溶于茶油 ,80 kg d - 1 - 1 mg· · , ip ,3 d ; 空白对照组不给任何药物 . kg d 按文献 [ 5～7 ] 方法诱导 , 制备微粒体和测定微粒体 蛋白质浓度 . 1. 4 体外孵育反应 取微粒体适量 ,加 2. 25 g· - 1 Triton X2100 溶液 L - 1 50 μ , 1 mol · Tris2HCl 溶 液 50 μ , 1 mol · - 1 L L L L MgCl2溶液 10 μ , 加底物适量 , 用 pH 7. 5 磷酸盐缓 L 冲液稀释至 1. 0 mL ,混匀 .使微粒体蛋白质浓度为
0. 2 g· - 1 ,底物终浓度为 1～40 mg· - 1 .在 25 ℃ L L 下 L 预孵育 3 min , 加 UDPG 溶液 20 μ , 启动反应 .孵 A
育一定时间后加 6 % HClO4 0. 5 mL 终止反应 , 加入
内标 ( 0. 1 g· - 1桑色素甲醇溶液) 10 μ ,用乙醚 2. 8 L L mL 和丙酮 0. 2 mL 的混合溶液提取 , 旋涡 2 min , 2000 ×g离心 10 min .取有机层于氮气流下挥干 ,用 100 μ 流动相溶解残渣 ,取 20 μ 进样 ,测定剩余底 L L 物浓度 .
2 结果与讨论
2. 1 最佳实验条件的选择
为求得酶反应的初速度 , 以便能较好地反映酶 的催化活性 .将山奈酚 ( 终浓度为 40 mg· - 1 ) 与不 L 同蛋白浓度微粒体 ( 0. 18 ,0. 36 ,0. 54 g· - 1 ) 在 25 ℃ L 分别孵育 3 ,6 ,10 min .图 12A 为酶反应进程曲线 , 可见在 0. 18 g· - 1浓度下 ,反应曲线基本呈线性 ,随 L
Fig 1. The reactive curve and the concentration curve for enzyme. A : The reactive curve for enzyme. ( ○)
microsomal concentration of 180 mg· - 1 , ( ●) 360 mg · - 1 , L L ) ( △ 540 mg· - 1 . B : The concentration curve for enzyme. ( ○ ) L ) ) reaction for 3 min , ( ● 6 min , ( △ 10 min.
2. 2 山奈酚在孵育液中的稳定性
为消除山萘酚在反应过程中因非代谢因素引起 的底物消耗所带来的误差 ,比较了不同孵育温度 ,不 同孵育时间对其稳定性的影响 .发现在 25 ℃下较 37 ℃ 下稳定 , 但即使在 25 ℃下 , 水浴震荡 45 min 仍
着酶浓度的增加曲线弯曲程度变大 , 反应速度下降 提前 .图 12B 为酶浓度曲线 ,时间为 3 min 的一条曲 线有较好的线性关系 , 而随反应时间增加曲线偏离 线性越大 .因此确定酶蛋白浓度 0. 18 g· - 1 , 反应 L 时间 3 min 为最佳实验条件 .
对各时间点测定值进行校正 .并选择 25 ℃作为孵 育温度 ,在氮气流下挥干有机溶剂 . 2. 3 山奈酚在不同来源微粒体中的代谢活性和代 谢2时间曲线 取不同处理的鼠肝微粒体适量 , 按体外孵育项 下方法 ,使山奈酚终浓度为 40 mg · - 1 , 于孵育 3 , L 10 ,20 ,30 ,45 min 后终止反应 , 测定剩余底物浓度 (表 1) .对不同时间孵育后山奈酚的浓度 ( ct ) 以
lg cO / ct ～ t回归 [8 ] ,得回归方程 DIPH : y = 0 . 0105 x + 0 . 0166 ( r = 0 . 996 ) ; 空白对照组 : y = 0 . 0017 x + 0 . 0155 ( r = 0 . 930 ) ; PB : y = 0 . 0022 x + 0 . 0169 ( r =
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有 10 % 左 右 的 量 被 损 耗 .故 为 减 少 误 差 , 在 做 代谢2时间曲线时采用空白对照进行校正 .即按实 际孵育时间做空白对照时间曲线 , 计算回归方程 , y = - 0 . 0078 x + 4 . 887 , 求出不同时间下的空白值 ,
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Tab 1. Metabolism of kaempferol in hepatic microsomes of rats treated with different agents
Residual concentration of kaempferol in incubates/ mg· - 1 L Group 0 Control DIPH BNF PB DEX 40. 0 40. 0 40. 0 40. 0 40. 0 3 38. 1 ± 83 0. 34. 7 ± 41 1. 34. 8 ± 53 3. 37. 6 ± 25 0. 37. 3 ± 72 0. 10 36. 2 ± 49 0. 30. 1 ± 55 4. 34. 2 ± 75 1. 36. 1 ± 43 0. 36. 4 ± 35 2. 20 34. 5 ± 63 0. 23. 6 ± 96 1. 28. 4 ± 12 5. 33. 8 ± 84 1. 33. 3 ± 18 0. 30 34. 9 ± 33 3. 20. 4 ± 74 3. 28. 7 ± 50 2. 32. 6 ± 36 2. 32. 2 ± 31 2. 45 ( min) 32. 8 ± 24 3. 14. 5 ± 11 5. 24. 0 ± 31 6. 31. 5 ± 81 2. 30. 5 ± 39 1. Metabolic rate / % 18. 0 ± 78 1. 62. 9 ± 2 22. 40. 1 ± 5 10. 21. 1 ± 89 1. 23. 7 ± 08 1.
BNF : y = 0 . 0044 x + 0 . 0279 ( r = 0. 959 ) .表明山奈
组 61. 9 min .反应速度常数 ( Ki ) 分别为 : DIPH 组 0. 0255 ;BNF 组 0. 0112 ; 空白对照组 0. 00413 ; PB 组 0. 00534 ; DEX 组 0. 00603 .以 上 结 果 表 明 BNF 和 DIPH 诱导的鼠肝微粒体对山奈酚代谢能力较强 . 从各种微粒体中代谢结果看 , 山奈酚在不同的细胞 色素 P450 同工酶中有广泛的代谢 . 2. 4 山奈酚酶动力学参数测定 取 BNF 和 DIPH 诱导的鼠肝微粒体和空白微粒 体 ,分别加入 25～2500 mg· - 1的山奈酚各 20 μ ,按 L L
DIPH : diphenytriazol ; BNF :β naphthoflavone ; PB : phenobarbital ; DEX: dexamethasone. The data in table are the average value for thrice 2 determination.
0. 957) ; DEX : y = 0 . 0025 x + 0 . 0159 ( r = 0. 968 ) ;
2 结果显示 , 空白微粒体酶对山奈酚有最大 表
的亲和力 , 而 DIPH 诱导的肝微粒体对山奈酚的葡 醛酸苷形成的催化能力最强 .
酚在各种微粒体孵育液中的反应属于一级反应 .孵
- 1
育液中 40 mg· 的山奈酚经 45 min 孵育后 , 分别 L 有 62. 9 % ( DIPH) , 40. 1 % ( BNF ) , 21. 1 % ( PB ) , 23. 7 % (DEX) 和 18. 0 % ( 空白组) 的量被代谢 .代谢 半衰期 ( t 1/ 2 ) 分别为 :DIPH 组 27. 2 min ; 空白对照组
2. 5 山奈酚代谢产物的确认
图 2 为山奈酚在 BNF 诱导的鼠肝微粒体中的
色 谱图 . 2A 为空白孵育液的色谱图 , 在内标物 图
和底物色谱峰处无任何峰出现 , 表明该实验条件下
167. 9 min ; PB 组 129. 7 min ;DEX 组 115. 0 min ;BNF
孵育液中各种成分不干扰山奈酚的测定 .图 2C 为 山 奈 酚 孵 育 3 min 后 的 色 谱 图 , 与 图 2B ( 不 加 小峰随孵育时间延长而增大 , 而底物峰随孵育时间
UDPG ) 相比 ,在 9 min 左右出现了 2 个小峰 ,该 2 个 A
延长而降低 ,认为该 2 个峰可能为代谢物葡萄糖醛 便准确定量 ,将流动相比例作适当调整 ,在二极管阵
酸苷结合物所致 .为使代谢物得到较好的分离 , 以 列检测器中测得色谱图见图 3 .在该流动相条件 物间的分离度 > 1. 3 .
下 ,2 代谢物的保留时间分别为 12 及 13 min ,2 代谢
1/ [ S] - 1/ v进行线性回归 , 计算得到山奈酚在 3 种 微粒体中的 Km , V max和 Cl int 值 ( 表 2) . Tab 2. Enzymatic parameters of metabolism in vitro
Inducer
V max/μ · mol
体外孵育反应项下方法操作 ,根据 Lineweveaver2Burk 方程 式 [9 ] : 1/ v = Km/ ( V max × [ S ] ) + 1/ V max , 以
kaempferol
g
- 1
山奈酚随孵育时间的消除趋势与 2 代谢物随时
间的增加趋势见图 4 .因代谢物无对照品 , 故采用
代谢物与内标的峰面积比值与时间曲线来描述代谢
物在孵育过程中的浓度变化情况 .由图 4 可见 , 山 趋势 ,而 2 个代谢物色谱峰面积在前 10 min 的增加 速度较快 ,以后增加速度减慢 ,40 min 时达最大 , 然 进一步代谢所致 . 后反应曲线呈缓慢下降趋势 , 可能为代谢物分解或 以上实验结果与文献报道一致 ,Oliveira 等 [10 ,11 ]
奈酚在前 10 min 的消除速度很快 ,10 min 后呈缓慢
· min
- 1
Km/μ · mol L
- 1
Clint / L·
- 1
min
· g
- 1
Control
2. 45 ± 63 0. 7. 55 ± 40 1. 25. 2 ± 08 1.
1. 85 ± 05 1. 9. 41 ± 45 2.
1. 32 ± 66 0. 0. 80 ± 05 0. 0. 35 ± 01 0.
BNF
DIPH
72. 4 ± 08 3.
Clint = V max/ Km . x ±s , n = 3.
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应用人 UGT21A9 微粒体和大鼠肝细胞研究山奈酚 和槲 皮 素 的 体 外 代 谢 , 获 得 同 样 结 果 , 提 出 黄 酮 类的葡萄糖醛酸苷结合反应主要是由UDP2葡醛酸
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Fig 2. HPLC chromatogram of kaempferol in rat hepatic microsomal incubates. A : chromatogram of blank
microsome ; B : chromatogram of blank microsome spiked with kaempferol , C : chromatogram of kaempferol incubated at 25 ℃for 3 min in the microsomes induced byβ naphthoflavone. Peaks : 1. in2 2 ternal standard ; 2. kaempferol ; 3 ,4. metabolites.
Fig 3. Chromatogram of kaempferol and metabolites incubated for 80 min. The mobile phase consisted of a mixed solu2 tion of pH 2 phosphate solution2tetrahydrofuran2methanol2isopropanol (80 : : : ) . Peak : 1. metabolite 1 ; 2. metabolite 2 ; 3. internal 11 6 18 standard ; 4. kaempferol.
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trahydrofuran2methanol2isopropanol (65: : : ) for the determi2 15 10 20 nation of kaempferol. Mobile phase 2 : pH 2 phosphate solution 2 tetrahydrofuran2methanol2isopropanol (80: : : ) for the deter2 11 6 18 mination of metabolites.
Fig 4. The concentration2time curve for kaempferol and metabolites. Mobile phase 1 : pH 2 phosphate solution2te2
转移 同 工 酶 UGT1A9 介 导 的 .作 者 的 实 验 结 果 , DIPH 和 BNF 诱导的鼠肝微粒体对山奈酚代谢作用 明显强于其他诱导剂诱导的酶和空白对照组 , 表明 这两种物质是葡醛酸转移酶的强诱导剂 .BNF 是经 典的药酶诱导剂 ,DIPH 为三氮唑类化合物 , 从作者 实验室研究结果 ,该化合物是一种新的药酶诱导剂 , 其诱导的药酶与 BNF 诱导的酶有相似功能 ( 待发 表) .两者诱导的是否是 UGT1A9 , 则有待于作进一 步实验确证 .
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Fig 5. Spectra of kaempferol and metabolites.
采用二极管阵列检测 , 比较代谢物与底物的紫 外吸收光谱图 ( 图 5) .由图 5 显示 ,代谢物 1 与底物 均在 370 nm 波长附近有最大吸收 , 而代谢物 2 在
350 nm 附近有最大吸收 ,吸收光谱曲线大致相近 .
考虑到葡醛酸结合物的水溶性较大 ,代谢物在水 相中的量可能较乙醚提取液中多 ,遂取经乙醚提取后 剩余的孵育液水相部分进行分析 ,结果见图 6 .代谢 物形成百分率由各反应时间点单个代谢物的峰面积 与浓度2时间曲线中达峰处两个代谢物峰面积和的比 值计算得到的.其结果与乙醚相中所得结果比较 ,代 谢物 1 与代谢物 2 在两相中的分配刚好相反 (比较图
4) ,代谢物 2 在乙醚相的分配较代谢物 1 多 ,而其在
水相中的分配较代谢物 1 少 ,说明其脂溶性较代谢物
1 大 ,这与其保留时间较代谢物 1 长是相一致的.
上述结果初步表明 ,2 个代谢物为山奈酚的葡 醛酸结合物 .此外 ,图 3 中保留时间约为 9 min 处还 有一小峰 ,其光谱图与其他代谢物及底物的光谱图 相似 ,此峰为代谢物还是其他有关物质所致将有待 于进一步研究 . 近年来黄酮类化合物的体内外代谢和其对药酶 的诱导抑制作用已引起了人们的关注 , Zhu 等 [12 ] 研 究表明黄酮类化合物对葡醛酸转移酶有一定的诱导
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Each point was the ratio of peak area of single metabolite to the peak area sum of these two metabolites at the maximum metabolism level in concentration2time curve.
作用 ,体外肝微粒体实验表明其对雌激素类的葡醛
酸结合有强的抑制作用 .由于黄酮类化合物广泛存 在于植物和日常饮食中 , 因此研究其体内外代谢机 制和其与其他药物或化合物在肝药酶分子水平上的 相互作用 ,具有重要的临床意义 .本结果为进一步
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Fig 6. Glucuronidation2time curve for kaempferol .
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研究该类化合物的体内生物转化过程和药物相互作 用提供了有益资料 .
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G Shao2J un , Y U AO T 2Wei , HU Jing ong
( Department of Drug Metabolism , College of Pharmacy , Zhejiang University , Hangzhou 310031 , China )
Abstract : AIM To explore which enzymes are related to the metabolism of Ginkgo biloba flavonoid and their kinetic parameters. METH2 ODS The metabolism of the flavonoid kaempfer2 ol was investigated in hepatic microsomes of rats treated with phenobarbital ( PB ) , dexamethasone (DEX) , β naphthoflavone ( BNF) , diphenytriazol 2 (DIPH) . The kaempferol was incubated with rat hepatic microsomes at 25 ℃ and the metabolites were determined by HPLC. RESUL TS The kaempferol was extensively metabolized after 45 min incubation with 62. 9 % of metabolic rate in the microsomes induced by DIPH , 40. 1 % by BNF , 21. 1 % by PB , 23. 7 % by DEX and 18. 0 % in control , respectively. Two glu2 curonides of kaempferol were detected. The Km of
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kaempferol in control microsomes and in micro2 somes induced by BNF or by DIPH was ( 1. 85 ± 1. 05) , ( 9. 41 ± 45 ) and ( 72. 4 ± 08 )μ · 2. 3. mol -1 L respectively ; Vmax was (2. 45 ± 63) , (7. 55 ± 0. - 1 1. 40) and ( 25. 2 ± 08 )μ · · - 1 , re2 1. min mol g spectively. CONCL USION DIPH and BNF , the two potent inducers of glucuronyltransferase could induce more potent glucuronidation of kaempferol in microsomes. Key words : kaempferol ; glucuronidation ; micro2 somes ; drug metabolism ; chromatography , high2 performance liquid
Foundation item : The project supported by Provincial Natural Science Foundation of Zhejiang(302682)
( 本文编辑 ) 石 涛
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