第十三章 生化药物和基因工程药物分析概念 1、 了解生化药物、基因工程药物的定义、种类.2、熟悉质量检验的基本程序与方法.3、掌握生化药物、基因工程药物的特点及常用的化学定量分析方法. 本章学习要点 人类用于预防、治疗和诊断疾病的三大主要药物 第一节 概述化学药物 生物药物 中药生物药物的定义:利用生物体、生物组织或器官等成分,综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物. 生物药物的分类: 生化药物 生物技术药物 生物制品 从生物体分离纯化制得的生化基本物质,以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的一类药物. 利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系即现代生物技术研制的药物称之. 应用普通的或基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备,用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品. 一、生化药物和基因工程药物的定义 1、生化药物的定义 从动物、植物及微生物提取的,也可用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等. 2、基因工程药物的定义 先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质,然后将控制该蛋白质合成过程的基因进行分离、纯化或人工合成,利用重组DNA技术加以改造,最后将该基因导入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达,并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质,通过这种方法生产的药物称之. 1、氨基酸、多肽与蛋白质类药物 二、生化药物和基因工程药物的种类 (一)生化药物的种类 (1)氨基酸及其衍生物:① 单氨基酸:亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等. ② 氨基酸衍生物:N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羟色氨酸.③ 复合氨基酸注射液:3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S复合氨基酸注射液.(S代表氨基酸的种类) (2)多肽类药物 :① 垂体多肽:促肾上腺皮质激素、促胃液素、加压素.② 消化道多肽:促胰液素(胰泌素)、胃泌素、抑胃肽.③ 下丘脑多肽:促甲状腺素释放激素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素. ④ 脑多肽:由人及动物脑和脑脊液中分离出来的多肽、蛋氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽等.⑤ 激肽类:血管紧张肽I、II、III等活性肽.⑥ 其它肽类:谷脱甘肽、降钙素、睡眠肽、松果肽、血活素(分子量为3000的肽为主成分). (3)蛋白类药物 猪或牛的纤维蛋白原、纤维蛋白、胃膜素(糖蛋白)、水蛭素、肝细胞生长因子;属蛋白质类激素尚有生长素、催乳素、促甲状腺素、促泡激素(FSH)、促黄体激素(LH);植物来源的蛋白类药物有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等. 2、酶类药物(1)助消化酶类:胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶.(2)蛋白水解酶类:溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶.(3)凝血酶及抗栓酶:凝血酶(猪、牛血)、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶. (4)抗肿瘤酶类:L-天门冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶.(5)其它酶类:细胞色素C、超氧化物歧化酶(SOD)、RNA酶、青霉素酶.(6)辅酶:CoA、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD). 3、多糖类药物(1)肝素、硫酸软骨素A和C、硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)、硫酸角质素、透明质酸等.(2)类肝素(酸性粘多糖)、鹿茸多糖、壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓多糖、人参多糖、黄芪多糖等. 4、脂质类药物 卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、麦角固醇、B谷固醇、胆汁酸(胆酸与甘氨酸或牛黄酸的结合物)、鹅脱氧胆酸、胆红素、原叶琳、血叶琳、亚油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列(PGE1、PGE2、PGE2a和PG12). 5、核酸类药物 RNA(包括iRNA-免疫核糖核酸)、DNA(脱氧核糖核酸)、聚肌苷酸、巯基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷.此外,有核酪制剂,6-巯基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和无环鸟苷等. 二、基因工程工药物的种类1、激素类及神经递质类药物(1)人生长激素释放抑制因子(2)人胰岛素(3)人生长激素2、细胞因子类药物(1)人干扰素 (2)人白细胞介素(3)集落刺激因子(4)促红细胞生长素3、酶类及凝血因子类药物 单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、反义药物、肿瘤坏死因子等. 1、共同特点:具有一定的生物活性或生理功能,能够参与、影响和调控人体代谢和生理功能,对于某些疾病的治疗具有针对性强、毒副作用小、易为人体所吸收等特点. 三、生化药物和基因工程药物的特点 2、分子量不是定值 除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激素等属化学结构明确的小分子化合物外,大部分为大分子物质,其分子量一般几千至几十万.对大分子的药物而言,即使组分相同,往往由于分子量不同而产生不同的生理活性. 3、结构确证难 在此类药物中,由于有效结构或分子量不确定,其结构的确证很难沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以证实,往往还要用生化法如氨基酸序列等法加以证实. 4、全过程的质量控制 此类药物对热、酸、碱、重金属以及pH较敏感,需对原材料、生产过程和最终产品进行质量控制. 5、生物活性检查 在制备多肽或蛋白质类药物时,有时因工艺条件的变化,导致蛋白质失活.因此,除了用通常采用的理化法检验外:尚需用生物检定法进行检定,以证实药物的生物活性. 6、安全性检查 由于此类药物性质特殊,生产工艺复杂,易引入特殊杂质和污染物,故常需做安全性检查.7、效价测定 对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定,以表明其有效成分含量的高低. 第二节 质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验 (一)理化鉴别法 利用化学法、物理法及生物学方法来确证生化药物的真伪.用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验. 1、化学反应法 通常利用药物与某试剂在一定条件下反应,生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别.例如,溶菌酶的鉴别采用呈色法;胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法. 2、HPLC法3、UV法 三磷酸腺苷二钠的分子中具有共轭系统,能吸收紫外光.本品的0.01mol/L盐酸水溶液(20μg/ml),在(257±1)nm的波长处有最大吸收.A250nm/A260nm的值应为0.17~0.27. (二)生化鉴别法 1、酶法:尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶,根据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原,而具有相同作用的链激酶不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别,并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作为判断指标. 2、电泳法 肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法:肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖,其水溶液带强负电荷,于琼脂凝胶板上,在电场作用下,向正极方向移动,与肝素国家标准品对照,其移动位置应相一致. 3、样品脱盐后等电点聚焦法测定 测定药物的等电点(为出现多条区带多个等电点),同批次同一产品的等电点应相同,表明其工艺稳定. (三)生物鉴别法:利用生物体进行试验来鉴别药物. 二、杂质检查 (一)一般杂质检查 检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等. (二)特殊杂质检查 许多药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得,药物中易残存一些杂质或其他成分.1、原料药的纯度分析2、生产过程中杂质检查 三、安全性检查 (一)热原检查法(家兔、鲎试剂)(二)异常毒性试验 :用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物,观察其急性毒性反应.反应的判断以试验动物死亡与否为终点. (三)过敏试验(检查异性蛋白)药物中若夹杂有异性蛋白,在临床使用时易引起病人多种过敏反应,轻者皮肤出现红斑或丘疹,严重者可出现窒息、发结、血管神经性水肿、血压下降,甚至休克和死亡. (四)降压物质检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质,包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质.来源:用动物脏器或组织为原料制备生化药物,正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质. (五)无菌检查法 (检查活菌)由于许多药物是在无菌条件下制备的,且不能高温灭菌.因此,无菌检查就更有必要.中国药典中几乎所有的注射用药如注射用尿激酶等,均做无菌检查. 1、无菌检查的基本步骤:① 培养基的制备,为细菌生长、繁殖提供所必需的营养物质碳源、氮源、维生素、矿物质等.② 选择对照用菌液,供对照试验用.③ 具体检查,如接种、培养等操作.④ 结果判断,得出阴性或阳性的结论. 2、注意事项:① 无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作法,包括对操作环境、试验材料及用具酶灭菌等,防止微生物污染.② 应避免在有抑菌条件下操作.③ 从事无菌操作人员应具备微生物学的基础知识及一定工作经验,否则要经过无菌技能的培训,方能从事此工作. (六)基因工程药物中可能杂质与污染物检查可能杂质:残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素等;主要污染物:微生物、热原、病毒等.主要检查项目:外源性DNA、其他外源性杂质测定 (七)致突变试验包括:微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试验等.(八)生殖毒性试验包括:一般生殖毒性试验、围生期毒性试验. 四、含量(效价)测定 含量表示方法 百分含量,适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物. 生物效价或酶活力,适用于酶类、蛋白质类等药物. (一)含量测定1、HPLC法2、SDS-PAGE法(二)效价测定:采用国际或国家参考品,或经国家检定机构认可的参考品,以体内或体外法测定其生物学活性,并标明其活性单位. 第三节 常用定量分析方法及其应用 一、理化法 (一)化学分析法1、重量法:根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量.(1)提取法 (2)挥发法 (3)沉淀法 (二)电化学分析法 离子选择性电极:测量离子活度的指示电极. 2、滴定分析法:根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定. (三)光谱分析法1、比色法:样品与显色剂可发生颜色反应,依颜色反应的强度测定含量.如蛋白质的含量测定,可利用蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应,而进行定量测定. 2、UV法:样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,其浓度与吸收度成正比,则可进行定量测定.如蛋白质在280nm左右有最大吸收 .3、荧光分光光度法:根据物质被UV光照射后产生的荧光强度进行定量测定. (四)色谱分析法1、HPLC法(1)RP-HPLC法:适用于肽类、氨基酸、蛋白质和多糖的测定,如生白能.固定相:C8、C18烷基硅烷键合相流动相:甲醇-水、乙腈-水(甲醇)、乙腈-缓冲液 (2)高效离子交换色谱法(HPIEC) HPIEC特点如下:① 蛋白质、多肽的分离是根据其相应的离子化程度而进行的. ② 分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱法进行的 ③ 柱效中等并具较高质量的活性回收. (3)高效凝胶过滤色谱法(HPGFC) HPGFC特点如下:① 活性蛋白质可得以回收. ② 分离是在固定比例的水溶液中进行的.③ 分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的. 2、高效毛细管电泳法(HPCE)HPCE是根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小,即荷质比不同产生不同的迁移速度而分离. 类型 酶活力测定法:以酶为分析对象,测定样品中某种酶的活力或活性,并用活力单位和比活性表示 . 酶分析法:以酶为分析工具或分析试剂,测定样品中酶以外的其它物质的含量. 二、酶法 (一)酶活力测定法 1、定义:酶活力是指酶催化一定化学反应的能力.酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示. 2、方法(1)终点法:在适当的条件下,把酶和底物混合,测定生成一定量产物所需的时间. (2)将酶和底物混合后隔一定时间,间断地或连续地测定反应的连续变化. (3)将酶与底物混合后,让其反应一定时间,然后停止反应,定量测定底物减少或产物生成的量. (二)酶分析法 1、动力学分析法:通过条件控制,分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用.则酶的反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系,通过测定酶反应速度即可求出它们的浓度. 2、总变量分析法(平衡法或终点法)根据被测物质(底物)的性质,选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用,在反应完成后,借助理化方法测出其总变化量,并参考反应的平衡点,计算出被测物的实际含量或浓度. 三、电泳法 (一)基本原理 电泳法是指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度泳动而使组分分离,再进行检测或计算百分含量的方法. (二)电泳法的分类1、自由界面电泳:在一根U形管里的溶液中,同种分子的构型及荷电情况基本一致,在电场影响下,它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面.2、高效毛细管电泳法(HPCE) 3、区带电泳:在电泳过程中,应用各种不同的惰性支持介质,在电场作用下,使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳.常用的支持物有:滤纸、醋酸纤维素薄膜、聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶(SDS - PAGE ). 四、生物检定法 (一)基本原理 生物检定法是利用药物对生物体(整体动物、离体组织、微生物等)的作用以测定其效价或生物活性的一种方法. (二)应用范围1、药物的效价:测定对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物可用生物检定法来控制药物质量.如洋地黄、胰岛素、肝素及各种抗生素. 2、大分子结构的测定 某些生物制品因结构复杂、分子量大,而且由结构类似、比例不定的多种成分组成,很难用理化方法反映其生物活性;某些药物虽可用理化方法测定含量,但不能完全反映效价.以上药物均采用生物检定. 3、微量生理活性物质的测定 一些神经介质,激素等微量生理活性物质,由于其很强的生理活性,在体内浓度很低,加上体液中各种物质的干扰,很难用理化方法测定.而不少活性物质的生物测定法因灵敏度高、专一性强,对供试品稍作处理即可直接测定.
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第十三章 生化药物和基因工程药物分析概念 1、 了解生化药物、基因工程药物的定义、种类.2、熟悉质量检验的基本程序与方法.3、掌握生化药物、基因工程药物的特点及常用的化学定量分析方法. 本章学习要点 人类用于预防、治疗和诊断疾病的三大主要药物 第一节 概述化学药物 生物药物 中药生物药物的定义:利用生物体、生物组织或器官等成分,综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物. 生物药物的分类: 生化药物 生物技术药物 生物制品 从生物体分离纯化制得的生化基本物质,以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的一类药物. 利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系即现代生物技术研制的药物称之. 应用普通的或基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备,用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品. 一、生化药物和基因工程药物的定义 1、生化药物的定义 从动物、植物及微生物提取的,也可用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等. 2、基因工程药物的定义 先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质,然后将控制该蛋白质合成过程的基因进行分离、纯化或人工合成,利用重组DNA技术加以改造,最后将该基因导入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达,并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质,通过这种方法生产的药物称之. 1、氨基酸、多肽与蛋白质类药物 二、生化药物和基因工程药物的种类 (一)生化药物的种类 (1)氨基酸及其衍生物:① 单氨基酸:亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等. ② 氨基酸衍生物:N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羟色氨酸.③ 复合氨基酸注射液:3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S复合氨基酸注射液.(S代表氨基酸的种类) (2)多肽类药物 :① 垂体多肽:促肾上腺皮质激素、促胃液素、加压素.② 消化道多肽:促胰液素(胰泌素)、胃泌素、抑胃肽.③ 下丘脑多肽:促甲状腺素释放激素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素. ④ 脑多肽:由人及动物脑和脑脊液中分离出来的多肽、蛋氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽等.⑤ 激肽类:血管紧张肽I、II、III等活性肽.⑥ 其它肽类:谷脱甘肽、降钙素、睡眠肽、松果肽、血活素(分子量为3000的肽为主成分). (3)蛋白类药物 猪或牛的纤维蛋白原、纤维蛋白、胃膜素(糖蛋白)、水蛭素、肝细胞生长因子;属蛋白质类激素尚有生长素、催乳素、促甲状腺素、促泡激素(FSH)、促黄体激素(LH);植物来源的蛋白类药物有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等. 2、酶类药物(1)助消化酶类:胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶.(2)蛋白水解酶类:溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶.(3)凝血酶及抗栓酶:凝血酶(猪、牛血)、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶. (4)抗肿瘤酶类:L-天门冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶.(5)其它酶类:细胞色素C、超氧化物歧化酶(SOD)、RNA酶、青霉素酶.(6)辅酶:CoA、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD). 3、多糖类药物(1)肝素、硫酸软骨素A和C、硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)、硫酸角质素、透明质酸等.(2)类肝素(酸性粘多糖)、鹿茸多糖、壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓多糖、人参多糖、黄芪多糖等. 4、脂质类药物 卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、麦角固醇、B谷固醇、胆汁酸(胆酸与甘氨酸或牛黄酸的结合物)、鹅脱氧胆酸、胆红素、原叶琳、血叶琳、亚油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列(PGE1、PGE2、PGE2a和PG12). 5、核酸类药物 RNA(包括iRNA-免疫核糖核酸)、DNA(脱氧核糖核酸)、聚肌苷酸、巯基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷.此外,有核酪制剂,6-巯基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和无环鸟苷等. 二、基因工程工药物的种类1、激素类及神经递质类药物(1)人生长激素释放抑制因子(2)人胰岛素(3)人生长激素2、细胞因子类药物(1)人干扰素 (2)人白细胞介素(3)集落刺激因子(4)促红细胞生长素3、酶类及凝血因子类药物 单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、反义药物、肿瘤坏死因子等. 1、共同特点:具有一定的生物活性或生理功能,能够参与、影响和调控人体代谢和生理功能,对于某些疾病的治疗具有针对性强、毒副作用小、易为人体所吸收等特点. 三、生化药物和基因工程药物的特点 2、分子量不是定值 除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激素等属化学结构明确的小分子化合物外,大部分为大分子物质,其分子量一般几千至几十万.对大分子的药物而言,即使组分相同,往往由于分子量不同而产生不同的生理活性. 3、结构确证难 在此类药物中,由于有效结构或分子量不确定,其结构的确证很难沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以证实,往往还要用生化法如氨基酸序列等法加以证实. 4、全过程的质量控制 此类药物对热、酸、碱、重金属以及pH较敏感,需对原材料、生产过程和最终产品进行质量控制. 5、生物活性检查 在制备多肽或蛋白质类药物时,有时因工艺条件的变化,导致蛋白质失活.因此,除了用通常采用的理化法检验外:尚需用生物检定法进行检定,以证实药物的生物活性. 6、安全性检查 由于此类药物性质特殊,生产工艺复杂,易引入特殊杂质和污染物,故常需做安全性检查.7、效价测定 对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定,以表明其有效成分含量的高低. 第二节 质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验 (一)理化鉴别法 利用化学法、物理法及生物学方法来确证生化药物的真伪.用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验. 1、化学反应法 通常利用药物与某试剂在一定条件下反应,生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别.例如,溶菌酶的鉴别采用呈色法;胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法. 2、HPLC法3、UV法 三磷酸腺苷二钠的分子中具有共轭系统,能吸收紫外光.本品的0.01mol/L盐酸水溶液(20μg/ml),在(257±1)nm的波长处有最大吸收.A250nm/A260nm的值应为0.17~0.27. (二)生化鉴别法 1、酶法:尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶,根据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原,而具有相同作用的链激酶不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别,并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作为判断指标. 2、电泳法 肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法:肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖,其水溶液带强负电荷,于琼脂凝胶板上,在电场作用下,向正极方向移动,与肝素国家标准品对照,其移动位置应相一致. 3、样品脱盐后等电点聚焦法测定 测定药物的等电点(为出现多条区带多个等电点),同批次同一产品的等电点应相同,表明其工艺稳定. (三)生物鉴别法:利用生物体进行试验来鉴别药物. 二、杂质检查 (一)一般杂质检查 检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等. (二)特殊杂质检查 许多药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得,药物中易残存一些杂质或其他成分.1、原料药的纯度分析2、生产过程中杂质检查 三、安全性检查 (一)热原检查法(家兔、鲎试剂)(二)异常毒性试验 :用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物,观察其急性毒性反应.反应的判断以试验动物死亡与否为终点. (三)过敏试验(检查异性蛋白)药物中若夹杂有异性蛋白,在临床使用时易引起病人多种过敏反应,轻者皮肤出现红斑或丘疹,严重者可出现窒息、发结、血管神经性水肿、血压下降,甚至休克和死亡. (四)降压物质检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质,包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质.来源:用动物脏器或组织为原料制备生化药物,正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质. (五)无菌检查法 (检查活菌)由于许多药物是在无菌条件下制备的,且不能高温灭菌.因此,无菌检查就更有必要.中国药典中几乎所有的注射用药如注射用尿激酶等,均做无菌检查. 1、无菌检查的基本步骤:① 培养基的制备,为细菌生长、繁殖提供所必需的营养物质碳源、氮源、维生素、矿物质等.② 选择对照用菌液,供对照试验用.③ 具体检查,如接种、培养等操作.④ 结果判断,得出阴性或阳性的结论. 2、注意事项:① 无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作法,包括对操作环境、试验材料及用具酶灭菌等,防止微生物污染.② 应避免在有抑菌条件下操作.③ 从事无菌操作人员应具备微生物学的基础知识及一定工作经验,否则要经过无菌技能的培训,方能从事此工作. (六)基因工程药物中可能杂质与污染物检查可能杂质:残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素等;主要污染物:微生物、热原、病毒等.主要检查项目:外源性DNA、其他外源性杂质测定 (七)致突变试验包括:微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试验等.(八)生殖毒性试验包括:一般生殖毒性试验、围生期毒性试验. 四、含量(效价)测定 含量表示方法 百分含量,适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物. 生物效价或酶活力,适用于酶类、蛋白质类等药物. (一)含量测定1、HPLC法2、SDS-PAGE法(二)效价测定:采用国际或国家参考品,或经国家检定机构认可的参考品,以体内或体外法测定其生物学活性,并标明其活性单位. 第三节 常用定量分析方法及其应用 一、理化法 (一)化学分析法1、重量法:根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量.(1)提取法 (2)挥发法 (3)沉淀法 (二)电化学分析法 离子选择性电极:测量离子活度的指示电极. 2、滴定分析法:根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定. (三)光谱分析法1、比色法:样品与显色剂可发生颜色反应,依颜色反应的强度测定含量.如蛋白质的含量测定,可利用蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应,而进行定量测定. 2、UV法:样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,其浓度与吸收度成正比,则可进行定量测定.如蛋白质在280nm左右有最大吸收 .3、荧光分光光度法:根据物质被UV光照射后产生的荧光强度进行定量测定. (四)色谱分析法1、HPLC法(1)RP-HPLC法:适用于肽类、氨基酸、蛋白质和多糖的测定,如生白能.固定相:C8、C18烷基硅烷键合相流动相:甲醇-水、乙腈-水(甲醇)、乙腈-缓冲液 (2)高效离子交换色谱法(HPIEC) HPIEC特点如下:① 蛋白质、多肽的分离是根据其相应的离子化程度而进行的. ② 分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱法进行的 ③ 柱效中等并具较高质量的活性回收. (3)高效凝胶过滤色谱法(HPGFC) HPGFC特点如下:① 活性蛋白质可得以回收. ② 分离是在固定比例的水溶液中进行的.③ 分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的. 2、高效毛细管电泳法(HPCE)HPCE是根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小,即荷质比不同产生不同的迁移速度而分离. 类型 酶活力测定法:以酶为分析对象,测定样品中某种酶的活力或活性,并用活力单位和比活性表示 . 酶分析法:以酶为分析工具或分析试剂,测定样品中酶以外的其它物质的含量. 二、酶法 (一)酶活力测定法 1、定义:酶活力是指酶催化一定化学反应的能力.酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示. 2、方法(1)终点法:在适当的条件下,把酶和底物混合,测定生成一定量产物所需的时间. (2)将酶和底物混合后隔一定时间,间断地或连续地测定反应的连续变化. (3)将酶与底物混合后,让其反应一定时间,然后停止反应,定量测定底物减少或产物生成的量. (二)酶分析法 1、动力学分析法:通过条件控制,分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用.则酶的反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系,通过测定酶反应速度即可求出它们的浓度. 2、总变量分析法(平衡法或终点法)根据被测物质(底物)的性质,选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用,在反应完成后,借助理化方法测出其总变化量,并参考反应的平衡点,计算出被测物的实际含量或浓度. 三、电泳法 (一)基本原理 电泳法是指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度泳动而使组分分离,再进行检测或计算百分含量的方法. (二)电泳法的分类1、自由界面电泳:在一根U形管里的溶液中,同种分子的构型及荷电情况基本一致,在电场影响下,它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面.2、高效毛细管电泳法(HPCE) 3、区带电泳:在电泳过程中,应用各种不同的惰性支持介质,在电场作用下,使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳.常用的支持物有:滤纸、醋酸纤维素薄膜、聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶(SDS - PAGE ). 四、生物检定法 (一)基本原理 生物检定法是利用药物对生物体(整体动物、离体组织、微生物等)的作用以测定其效价或生物活性的一种方法. (二)应用范围1、药物的效价:测定对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物可用生物检定法来控制药物质量.如洋地黄、胰岛素、肝素及各种抗生素. 2、大分子结构的测定 某些生物制品因结构复杂、分子量大,而且由结构类似、比例不定的多种成分组成,很难用理化方法反映其生物活性;某些药物虽可用理化方法测定含量,但不能完全反映效价.以上药物均采用生物检定. 3、微量生理活性物质的测定 一些神经介质,激素等微量生理活性物质,由于其很强的生理活性,在体内浓度很低,加上体液中各种物质的干扰,很难用理化方法测定.而不少活性物质的生物测定法因灵敏度高、专一性强,对供试品稍作处理即可直接测定.