1 SHODEX SUGAR 系列糖分析 目录Page 第1章 前言-1 1. 前言 1 2. 配位交换模式-1 3. 糖的端基异构体分离-2 第2章 色谱柱的选择方法 3 第3章SUGAR 系列的基本特性 6 1. SP0810、SC1011、KS-800 系列-6 ·特长-6 ·分离比较-6 ·定量性-6 ·回收率-6 ·流量依存性 8 ·温度依存性-9 ·标准曲线 10 2. SH1011、1821-11 ·特长-11 ·分离机制-11 ·温度依存性-12 ·流动相浓度依存性-13 ·定量性-14 3. SZ5532、SC1211-15 ·特长-15 ·流动相组成比的影响-15 ·定量性-17 第4章 食品中糖的分析-18 1. 样品的前处理(营养表示基准)18 2. 样品的前处理(其它)19 3. 分析例-19 4. 食物纤维的分析 23 第5章 使用注意事项 24 1. 流动相的调制 24 2. 样品调整-24 3. 色谱柱的连接 25 4. 色谱柱的再生 25 5. 色谱柱的保护 25 第6章 应用实例-26 附录 糖的保留体积一览表-32 2 前言 1.前言 Shodex SUGAR 系列是以糖类及糖醇的分离、分析为目的的高性能填充色谱柱.填充剂是 专为分析糖而设计的硬质苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质,官能团为磺酸基上键合了金属 对离子的强阳离子交换树脂. 最适合分析食品领域的生物化学、 天然产物等的糖的分离和分 析. Shodex SUGAR 系列根据对离子、孔径、孔结构不同可分为 13 种不同类型(表1-1) ,对每 种糖的选择性也不同.Shodex 针对其它的糖分析色谱柱也有.详情请参考 Shodex 产品目录 或登陆 Shodex 主页 http://www.shodex.com 表1-1 Shodex SUGAR 系列规格 产品名称 对离子 分离模式 排阻限 理论塔板数 规格 SH1011 SH1821 SH-G H+ H+ H+ 尺寸排阻+离子排除 尺寸排阻+离子排除 (保护柱) 1,000 10,000 - 15,000 15,000 - 8.0*300 8.0*300 6.0*50 SC1011 SC1821 SC-LG Ca2+ Ca2+ Ca2+ 尺寸排阻+配位交换 尺寸排阻+配位交换 (保护柱) 1,000 10,000 - 12,000 12,000 - 8.0*300 8.0*300 6.0*50 SP0810 SP-G Pb2+ Pb2+ 尺寸排阻+配位交换 (保护柱) 1,000 - 10,000 8.0*300 6.0*50 SC1211 SC-G Ca2+ Ca2+ 分配吸附+配位交换 (保护柱) - - 6.0*250 4.6*10 SZ5532 SZ-G Zn2+ Zn2+ 分配吸附+配位交换 (保护柱) - - 6.0*150 4.6*10 KS-801 KS-802 KS-803 KS-804 KS-805 KS-806 KS-G Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ 尺寸排阻+配位交换 尺寸排阻+配位交换 尺寸排阻 尺寸排阻 尺寸排阻 尺寸排阻 (保护柱) 1,000 10,000 50,000 400,000 5,000,000 (50,000,000) - 15,000 15,000 15,000 15,000 8,000 8,000 - 8.0*300 8.0*300 8.0*300 8.0*300 8.0*300 8.0*300 6.0*50 2.配位交换模式 Shodex SUGAR 系列的特长是起分离作用得是配位交换模式. 配位交换是利用羟基与金属 离子形成络合体的相互作用 (配位交换能) 的分离模式. 糖类为 5 元环 (呋喃) 或6元环 (吡喃)结构,分子内含有多个羟基.这些羟基,相对于碳平面,呈水平方向和垂直方向与碳结 合. 这些羟基的立体结构根据糖种类不同而不同. 图3为羟基的立体结构与对离子的相互作 用的关系. 图3(a)为三个羟基与金属离子形成络合. 图3(b)由于羟基的立体结构只有两个羟基 与金属离子形成络合. 因此, (a)的配位交换能强. 配位交换能根据金属离子种类不同而不同. 图1-1 配位交换能 (a) (b) 3 络合力根据对离子金属离子种类的不同而不同.对离子形成络合力由弱到强的顺序依次是: Ag+ SC>KS,对糖的保留力强弱顺序也是如此. <分离比较> 图3-1 为三种色谱柱对糖和甘油、乙醇的标准品分析结果比较.KS-801 是以尺寸排阻为 主,分子量接近的物质(葡萄糖、果糖、山梨醇)分离不是很好,但其它两种色谱柱可以很 好分离.单糖类(葡萄糖和果糖)的分离按 KSSC>SP,这也影 响到各成分的峰形是否尖锐.配位交换对离子越强,端基异构体分离力越强,峰宽,分离结 果差.寡糖分离按照尺寸排阻模式的洗脱顺序.糖醇(山梨醇)按照 KS SUGAR 系列不管哪根色谱柱都具有好的线性,适合定量分析. 图3-2 标准曲线(SP0810) Column: Shodex SUGAR SP0810 Eluent: H2O Flow rate: 0.6mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ <回收率> SUGAR 系列基本上任何样品都可得到 100%的回收率. 表3-2 SP0810 对糖的回收率 Recovery(%) Glucose 100.4 Sucrose 99.9 Raffinose 98.0 Stachyose 99.3 Lactitol 98.8 表3-1 相关系数(R2) Glucose 0.9999 Fructose 0.9999 Lactose 1.0000 Maltose 0.9992 Mannitol 0.9999 Xylitol 0.9997 Sorbitol 0.9996 (250μ g~0.05μ g) 分析条件参考图 3-1 Column: Shodex SUGAR SP0810 Eluent: H2O Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ 9 <流量依存性> 降低流量,理论塔板数升高,分解能提高. 图3-3 SC1011 在不同流量下糖分离比较 Column: Shodex SUGAR SC1011 Eluent: H2O Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ 图3-4 流量对分离度的影响 图3-5 流量与理论塔板数的关系 分析条件参考图 3-3 注)分离度的计算方法 Resolution(%)=h/{(h1+h2)/2}*100 Sample: 0.5%each,5μ l 1. Isomaltotriose 2.Sucrose 3.Glucose 4.Lactitol 5.Fructose 6.meso-Erythritol 7.Mannitol 8.Dulcitol 9.Xylitol 10 <温度依存性> 具有羰基或醛基的糖,由于端基异构体的分离,因此需在高温下分析可以控制异构 体分离,峰形尖锐,分离能提高. (详情参考 P2) SP0810,SC1011,SC1821,KS-800 系列推荐在 80℃高温下分析. 图3-6 分析温度对糖的分离比较 Column: Shodex SUGAR SC1011 Eluent: H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI 图3-7 分析温度对分离度的影响 图3-8 不同分析温度下的理论塔板数及 对洗脱时间的影响 分析条件参考 3-6 注)分离度的计算法 :理论塔板数 参考图 3-4 的注) :保留时间 分析条件参考图 3-6 11 <标准曲线> Shodex 还备有适合多糖分析的 KS-800 系列,OHpak SB-800 HQ 系列,Asahipak GS HQ 系列等的 GFC 模式色谱柱.根据分析目的进行选择. 详情请登陆 Shodex 主页. (http://www.shodex.com/china/dc0602.html) 图3-9 标准曲线(KS-800 系列) Column: Shodex SUGAR KS-801,802,803,804,805,806 Eluent: H2O Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ 12 2. SH1011,SH1821 <特长> ·利用离子排除模式,分析含有有机酸的糖. ·最适合分析发酵产品中的糖、有机酸、醇等. ·可分析含有醛糖酸和糖醛酸等的糖酸的样品 ·SH1821 孔径大,可分析含有寡糖的样品. <分离机制> 流动相使用如硫酸水溶液等酸性溶液,可抑制有机酸的解离,疏水性增强,样品被反 相保留.但是,毕竟有机酸存在部分解离,色谱柱的负电荷(磺酸基)与有机酸的负电荷相 互排斥,快速洗脱出来.解离越大的有机酸洗脱越快.这个机制为离子排除模式.另外, 糖根据尺寸排阻模式洗脱. 图3-10 SH1011 糖和有机酸混合物的分离 SH1011 与SP0810,SC1011,KS-801 相比疏水性强,因此醇类物质按反相模式可完全分 离. 图3-11 SH1011 对醇类的分析 Column: Shodex SUGAR SH-G+SH1011 Eluent: 5mM H2SO4-H2O Detector: Shodex RI Column temp.:60℃ Column: Shodex SUGAR SP0810 Eluent: H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:60℃ Sample: 0.5%each,20μ l 1. CH3OH 2.EtOH 3.i-C3H7OH 4.n-C3H7OH 5.t-C4H9OH 6.sec-C4H9OH 7.i-C4H9OH 8.n-C4H9OH 9.i-C5H11OH 10 n-C5H11OH 13 <温度依存性> SH 类型色谱柱由于填料树脂自身有分解催化剂的作用,如蔗糖和棉籽糖等遇酸加水易分 解的样品,建议在室温下分析. 图3-12 SH1011 分析温度的影响 图3-13 显示了随着分析温度的改变,有机酸不同种类,洗脱体积都有很大变化.糖基本 无影响. 图3-13 分析温度(60℃→25℃)与洗脱体积 Column: Shodex SUGAR SH1011 的变化率的关系 Eluent: 5mM H2SO4-H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Sample conc.:0.5% Injection vol.:5μ l Sample:Raffinose 0.5%, 5μ l Column: Shodex SUGAR SH1011 Eluent: 5mM H2SO4-H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:(A) 60℃,(B)25℃ 14 <流动相浓度依存性> 有机酸分析时,流动相的浓度越浓(PH 值低)越难解离,洗脱体积会变大.糖基本无 影响. 图3-14 流动相浓度(5mM H2SO4→20mM H2SO4)与洗脱体积的变化率 Column: Shodex SUGAR SH1011 Column temp.:60℃ Eluent: 5~20mM H2SO4-H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Sample conc.:0.5% Injection vol.:5μ l 15 <定量性> SH 系列与其它 SUGAR 系列一样,具有优异的线形. 图3-15 标准曲线(SH1011) Column: Shodex SUGAR SH1011 Eluent: 5mM H2SO4-H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI (Sugar) Shodex UV(210nm) (Organic acid) Column temp.:60℃ 表3-3 相关系数 Isomaltose 0.9999 Xylitol 0.9999 Maltitol 1.0000 Acetic acid 1.0000 Propionic acid 1.0000 Adipic acid 0.9997 (0.2μ g~250μ g) 分析条件参考图 3-15 16 3. SZ5532, SC1211 <特长> ·反相模式与配位交换模式分离糖. ·流动相的乙腈含量增加,糖的保留力增强. ·SZ5532 适合二糖、三糖的分离.特别是麦芽糖与异麦芽糖的分离. ·SZ5532 适合糖和糖醇的分离. ·SC1211 适合糖醇和醇类物质的分离. <流动相组成比的影响> SC1211 分离机制是正相模式,有机溶度增加,糖醇的洗脱会变慢,这是因为糖醇在 有机溶剂中与对离子的相互作用变强.但是,有机溶剂浓度对糖的洗脱影响不大,糖在 最初被洗脱出来. 图3-16 SC1211 醇分离时乙腈浓度的影响 Column: Shodex SUGAR SH1011 Detector:Shodex RI Eluent:CH3CN/H2O Column temp.: 70℃ 图3-17 SC1211 分离糖醇时乙腈浓度与洗脱体积的关系 17 SC1211 最适合醇类的分离.与反相不同,随着有机溶剂的增加,糖醇的洗脱变快. SZ5532 与SC1211 相同,正相模式发挥作用,随着有机溶剂得增加,糖醇的洗脱变慢. 图3-18 SC1211 分析糖醇时乙腈浓度的影响 SZ5532 使用了分配吸附用膨胀收缩 非常小的高架树脂填料.对离子是 Zn2+. SZ5532 与SC1211 一样,随着有机溶剂 浓度的增加,洗脱变慢,对糖类的影响 与SC1211 不同. Column: Shodex SUGAR SZ5532 Eluent: CH3CN/H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:60℃ Column: Shodex SUGAR SC1211 Eluent: CH3CN/H2O Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:70℃ 18 <定量性> SZ5532 与其它 SUGAR 系列一样,具有优异的线形. 表3-4 相关系数 图3-20 标准曲线(Shodex SUGAR SZ5532) Column: Shodex SUGAR SZ5532 Eluent: CH3CN/H2O=75/25 Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:60℃ Injection vol.:10μL Sucrose 1.0000 Maltose 1.0000 Isomaltose 0.9999 Maltotriose 1.0000 Raffinose 1.0000 Meso-Erythritol 1.0000 Myoinositol 0.9999 Stevioside 1.0000 (1~200μ g) 分析条件请参考图 3-20 19 第3章 食品中糖的分析 1 样品的前处理(营养表示基准) 食品中除含有糖以外,还有蛋白质和脂质.因此,分析食品中的糖通过 HPLC 法分析 时, 对食品中的糖进行萃取后, 有必要对糖以外的其它成分进行去除. 这个过程为前处理. 下面为平成 10 年4月1日实行的营养表示基准中记载的前处理方法. 1-1 样品的调制 样品如果是固体,用咖啡研磨机进行粉碎. 1-2 样品溶液的调制 ① 基本操作 50mL 烧杯中称量样品 0.5~5g ↓ 添加 30mL 纯水,超声萃取 30min. ↓(液体呈酸性时添加 10w/v% NaOH 中和) 添加纯水定容至 50mL ↓ (含有不溶物时用 No.5B 滤纸过滤) 滤膜(0.45μ m)过滤,滤液适量稀释后 HPLC 使用. ② 含蛋白质或多糖多的食品 ① 的操作中将水用 50v/v%甲醇代替. ③ 含盐多的食品 ① 和②调制后的样品溶液 5~10mL 通过电透析装置 (或离子交换树脂) 进行脱盐. ④ 脂质多的食品 50mL 离心分离管中称量样品 0.5~5g. ↓ 添加石油醚 40mL,不时搅拌并放置 15min. ↓ 离心分离(2,000rpm,10min)后,倾斜法去除上层清液. ↓ 重复*,氮气流中或 40℃的水浴中将残留的石油醚完全蒸发. ↓ 按①或②的操作进行. 20 2 样品前处理(其它) 三氯乙酸溶液或固相萃取去除蛋白质的方法简单有效.简单介绍如下. 2-1 三氯乙酸去除蛋白质的方法 向样品溶液中添加 5~10%浓度的三氯乙酸溶液(100w/v%)充分混合. ↓ 放置至沉淀不再生成后,离心分离去除沉淀. ↓ 添加乙醚振荡,取水层液体,并重复三次相同操作去除三氯乙酸后, 水层液体为分析样品. 2-2 固相萃取去除蛋白质 聚合物填充的固定相或 C18 填充的固定相用甲醇和水进行调整. ↓ 样品溶液通过,收集最快流出的部分. 2-3 乳制品 对于难过滤的乳制品,使用超滤(分子量:10,000)法有效. 3 分析实例 图4-1 SP0810 分析(标准品) 图4-2 SC1011 分析(标准品) Column: Shodex SUGAR SP0810 Column: Shodex SUGAR SC1011 Eluent: H2O Eluent: H2O Flow rate:0.6mL/min Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Detector: Shodex RI Column temp.:85℃ Column temp.:85℃ 21 (前处理) 在烧杯中称量加糖酸奶 5g, 加纯水 30mL 搅拌,加10w/v% NaOH 溶液中和. ↓ 30min 超声萃取后,纯水定容至 50mL ↓ No.5B滤纸过滤后, 0.45μ m过滤膜过滤, 滤液用做 HPLC 样品. Column: Shodex SUGAR SP0810 Eluent: H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI 图4-3 加糖酸奶 Column temp.:85℃ 烧杯中称量苹果饮料 5g,加纯水 30mL 搅拌 搅拌,10w/v%NaOH 溶液中和. ↓ 30min 超声萃取,加纯水定容至 50mL ↓ 0 .45μ m 过滤膜过滤, 滤液用做 HPLC 样品 Column: Shodex SUGAR SP0810 Eluent: H2O Flow rate:0.6mL/min Column temp.:85℃ 图4-4 苹果饮料 离心管中称量巧克力饼干 5g,加石油醚 40mL 搅拌 15min 后, 离心分离(2,000rpm *10min)后,倾斜法去除上层清液. ↓ 再次石油醚处理,残留的石油醚在 40℃ 水浴中完全蒸发. ↓ 加纯水 30mL 搅拌,30min 超声萃取后, 超纯水定容 50mL ↓ No.5B 滤纸过滤后, 超滤. 取一部分滤液, 图4-5 巧克力饼干 加等量的乙腈. Column: Shodex SUGAR SP0810 ↓ Eluent: H2O 0.45μ m 过滤膜过滤,滤液用于 HPLC Flow rate:0.6mL/min Column temp.:60℃ 22 (前处理) 样品被混频器绞碎,用纯水稀释 50 倍. ↓ 30min 超声萃取. ↓ No.5B 滤纸过滤,0.45μ m 过滤膜过滤,滤液 用于 HPLC 分析 Column: Shodex SUGAR SP-G + SP0810*2 Eluent: H2O Flow rate:0.4mL/min Detector:Shodex RI 图4-6 烤土豆 Column temp.:80℃ 豆粉用纯水稀释 50 倍. ↓ 超声萃取 30min. ↓ 超滤后,滤液用 0.45μ m 过滤膜过滤, 滤液用作 HPLC 分析. Column: Shodex SUGAR SP-G + SP0810*2 Eluent: H2O Flow rate:0.4mL/min Detector:Shodex RI Column temp.:80℃ 图4-7 烤豆粉 辣酱油用纯水稀释 5 倍. ↓ 超声萃取 30min. ↓ 0.45μ m 过滤膜过滤,滤液用作 HPLC 分析. Column: Shodex SUGAR KS-801 Eluent: H2O Flow rate:0.7mL/min Detector:Shodex RI Column temp.:80℃ 图4-8 辣酱油 23 图4-9 糖果 Column: Shodex SUGAR SC1011 or SC1821 Detector: Shodex RI Eluent: H2O Column temp.: 80℃ Flow rate: 0.6mL/min Injection vol.: 5μ l (前处理) 糖果 1 个溶解于 20mL 纯水中,搅拌 1 小时. ↓ 0.45μ m 过滤膜过滤,滤液用作 HPLC 分析. 图4-10 覆盆子果酱 分析条件参考图 4-9 (前处理) 覆盆子果酱 5g 溶解于 20mL 纯水中,搅拌 1 小时. ↓ 0.45μ m 过滤膜过滤,滤液用作 HPLC 分析. 24 4.食物纤维的分析 食物纤维的定量法有几种,其中 Prosky 法(酶-重量法)可靠性高,被广泛应用. Prosky 法指一系列的酶处理后,未分解的多糖和木质素为食物纤维.水溶性食物纤维 中一系列的酶处理后,约80%的在乙醇中不沉淀的低分子水溶性食物纤维,其定量分析 采用 HPLC.分析目的是对三糖以上的难消化成份(难消化寡糖+食物纤维)与其它成分 (单糖、二糖、糖醇)分开,计算难消化成分的比率. Shodex 低分子水溶性食物纤维分析用色谱柱有 Sugar KS-802 和Asahipak GS-220 HQ. 图4-11 GS-220 为尺寸分离模式,单糖、二糖及糖醇在箭头位置后洗脱出来,与难消化成 份很好分离,对低分子水溶性食物纤维进行准确定量. 图4-12 是KS-802 的分析实例,对单糖、二糖的分离效果好. 表4-1 GS-220 HQ 各种糖的洗脱体积 图4-11 GS-220HQ 对低分子食物纤维的分析 Column: Shodex SUGAR GS-220HQ*2 Eluent: H2O Flow rate: 0.6mL/min Detector: Shodex RI Column temp.: 80℃ Column: Shodex SUGAR KS-802*2 Eluent: H2O Flow rate: 0.3mL/min Detector: Shodex RI Column temp.: 80℃ 图4-12 KS-802 对低分子食物纤维的分析 标准品 Ve (mL) 标准品 Ve(mL) Glycerol 17.83 Maltose 16.11 Meso-Erythritol 17.38 Sucrose 16.26 Xylitol 16.88 Isomaltotriose 14.72 D(-)-Sorbitol 16.60 D(+)-Raffinose 15.08 Lactitol 15.50 1-Kestose 15.31 Maltitol 15.82 Maltotriose 15.56 D(+)-Xylose 17.46 Stachyose 14.33 D(+)-Galactose 16.60 Nystose 14.72 D(+)-Glucose 16.75 Malopentaose 14.82 D(-)-Fructose 17.05 1F-Fructofuranosy- nystose 14.24 Isomaltose 15.57 Maltohexaose 14.56 Lactose 15.71 Maltoheptaose 14.31 25 第4章 使用注意事项 本章介绍 Shodex SUGAR 系列在使用上的注意点,以尽可能达到长期高效使用. 1.流动相的调制 流动相使用的水,请使用脱离子水(纯水) .流动相中如果存在其它的金属离子,会导 致对离子被置换,色谱柱劣化.填料对离子种类不同,膨胀度也不相同,因此,对离子种类 改变,填料会发生膨胀收缩.另外,纯水放置时间长,空气中的杂质或微生物污染,因此请 使用新调配的流动相.对色谱柱来说重要的因素是污染、杂质和气泡.流动相需用 0.45μ m 的过滤膜过滤使用.特别是 SUGAR 系列色谱柱要加热使用,为避免色谱柱内及色谱柱出口 产生气泡,必须对流动相进行脱气.建议在泵前使用在线脱气机(DEGASSER) . SP0810,SC1011,SC1821,KS-800 基本上使用纯水做流动相.酸性糖与氨基糖易解离的样品分析时,为防止离子排除和色 谱柱的吸附,请在流动相中添加盐.此时,请选择与对离子相同的阳离子的盐. SP 类型 … Pb(NO3)2 * *含铅离子时,废液的处理一定要遵从指定方法 SC 类型 … CaSO4 KS 类型 … NaCl SH1011,SH1821 流动相只用纯水也可以分析,但碱性物质吸附会使得分离模式改变.因此,建议在纯水中添 加硫酸和磷酸等酸做为流动相使用. *硫酸水溶液如果留在系统里,会与配管或色谱柱金属,生成氢气,因此分析结束后置换为 纯水. SC1211,SZ5532 流动相使用纯水与有机溶剂(一般为乙腈)的混合溶剂.有机溶剂使用 HPLC 用溶剂. 2.样品调整 2-1 脱盐处理 第4章样品的前处理已经说明,SUGAR 系列样品中如果混有其它金属离子的话,会发生 离子置换导致色谱柱劣化.因此,如果样品中含有金属离子的话,请提前去除.下面介绍几 个脱盐的例子. *KS-800 系列对离子为 Na+,因此样品中含有食盐(NaCl) ,不需脱盐处理也可直接分析. 例1) 市场上的离子交换树脂(阳离子、阴离子)活化后,装填入一次性注射器中,将样 品通过,收集最快通过的组分. (也可选用固相萃取柱) 例2) 需要特别去除 NaCl 时用Ag 型阳离子交换树脂.Cl-作为 AgCl 沉淀去除,Na+被阳离子交换树脂吸附,可简 单脱盐.详情参考 Shodex 主页. 例3) 使用电透析装置. 26 2-2 样品溶解 SUGAR 系列流动相只用纯水, 或用与有机溶液的混合溶液, 溶解样品尽可能与流动相接 近.例如,SC1211 或SZ5532 分析时,样品用混合溶剂溶解.但是有的糖使用有机溶剂很难 溶解,此时,可先用纯水溶解糖后,再添加有机溶剂. 3 色谱柱的连接 SUGAR 系列的色谱柱基本上都是高温分析. 色谱柱连接入系统时, 首先 0.2mL/min 流量 送液,待色谱柱升高至设定温度后,再缓慢升高流量至设定值.分析结束后,流动相充 分流过后,流量降低为 0.2mL/min,待色谱柱降为室温时再停泵.从系统中取下色谱柱, 色谱柱两端用堵头密封. 4 色谱柱的再生 SUGAR 系列的对离子被置换为其它离子后,分离模式改变,最终损坏.因此,出现这种 情况时,可参考下面的方法对色谱柱进行再生. 表5-1 色谱柱的再生法 类型 再生液 色谱柱温度 操作 SP0810 200mM Pb(NO3)2 70~95 纯水 0.5mL/min 送液,再生液 50μ L 进样 3~4 次. SC1011 SC1821 100mM Ca(NO3)2 50 再生液 0.5mL/min 送液 50mL, 然后纯水充分洗 净. KS-800 10mM NaOH 50 再生液 0.5mL/min 送液 50mL, 然后纯水充分清 洗.另外纯水 0.5mL/min 送液,0.1M NaOH 水 溶液 40μ L 注射器注入. SH1011 SH1821 2.5mM H2SO4 50 再生液 0.5mL/min 送液 50mL. SC1211 100mM Ca(NO3)2 50 纯水置换后,再生液 0.5mL/min 送液 30mL, 然后纯水充分清洗.缓慢添加有机溶剂,置换 为分析用溶剂. SZ5532 100mM Zn(NO3)2 50 纯水置换后,再生液 0.5mL/min 送液 30mL, 然后纯水充分清洗.缓慢添加有机溶剂,置换 为分析用溶剂. ? 对离子置换严重或杂质吸附时,上述方法无法通过再生使柱效回复. 5. 色谱柱的保护 样品的前处理无法完全去除蛋白质和脂类物质时,请使用保护柱. 27 第5章 应用实例 <色谱柱组合分离比较> Sample:0.5% each, 20μ L 1. Lactose 2. Lactulose 3. Glucose 4. Galactose 5. Fructose Column:Shodex SUGAR KS-801,SC1011,SP0810 Eluent:H2O Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ 28 <葡聚糖加水分解时的变化> (加水分解流程) 4%葡聚糖水溶液在 1M HCl,100℃条件下加水分解. 每10min 搅拌,冷却后加 1M NaOH 进行中和. 离子交换树脂(阴离子交换树脂、阳离子交换树脂)通液,进行脱盐. 0.45μ m 过滤器过滤,滤液用做 HPLC 分析. Column:Shodex SUGAR KS-802*2 Eluent:H2O Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ Sample:2%,20μ L 29 <农作物中的糖的分离> <食品中的帕拉金糖> Column:Shodex SUGAR SC1011 Column:Shodex SUGAR SC-LG+SC1011 Eluent:H2O Eluent:H2O Flow rate:1.0mL/min Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ Column temp.:80℃ <寡糖的分离> <木材构成糖> Column:Shodex SUGAR SC1821 Column:Shodex SUGAR SP0810 Eluent:H2O Eluent:H2O Flow rate:1.0mL/min Flow rate:0.6mL/min Detector: Shodex RI Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ Column temp.:85℃ 糖和糖醇 30 <糖和糖醇> <麦芽糖与异麦芽糖> Column:Shodex SUGAR SZ5532 Column:Shodex SUGAR SZ5532 Eluent:CH3CN/H2O=80/20 Eluent: CH3CN/H2O=75/25 Flow rate:1.0mL/min Flow rate:0.9mL/min Detector: Shodex RI Detector: Shodex RI Column temp.:60℃ Column temp.:60℃ <糖和氨基酸> <糖和氨基酸(1)> Column:Shodex SUGAR SP0810 Column:Shodex SUGAR SC1011 Eluent:20mMPb(NO3)2(PH3.8) Eluent: 0.1M CaSO4(PH6.0) Flow rate:0.7mL/min Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Detector: Shodex RI Column temp.:60℃ Column temp.:60℃ <糖和氨基酸(2)> Column: Shodex SUGAR SC1211 Eluent:CH3CN/H2O=40/60 Flow rate: 0.6mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:70℃ Sample:15μL 1 Glucose 2Maltose 3 Isomaltose 4 Maltotriose 5 Isomaltotriose 糖与氨基酸、氨基酸 31 <发酵副产物>(典型溶液) Column: (A)shodex SUGAR SH-G+SH1011 Detector:Shodex RI (B)Shodex SUGAR SH-G+SH1821 Shodex UV(210nm) Eluent:0.01N H2SO4-H2O Column temp.:50℃ Flow rate:0.75mL/min <果汁饮料> <唾液酸> Sample:10μ L 1 0.125mg/mL N-Acetyl-Neuraminic acid(Sialic acid) 2 1.25mg/mL Glucose 3 1.25mg/mL Mannose 4 1.25mg/mL Fucose 5 0.125mg/mL N-Acetyl-D-Glucosamine 6 0.125mg/mL N-Acetyl-D-Galactosamine Column: Shodex SUGAR SH-G+SH1821 Eluent:5mM H2SO4-H2O Flow rate: 1.0mL/min Detector: Shodex RI Shodex UV(210nm) Column temp.:50℃ <清凉饮料> Column:Shodex SUGAR SH1011 Eluent:5mM H2SO4-H2O Flow rate: 0.6mL/min Detector: Shodex RI, UV(210nm) Column: Shodex SUGAR SH1011 Eluent: 3mM HClO4-H2O Flow rate: 1mL/min Detector: Shodex RI 糖与有机酸 32 <多糖> <普鲁兰与寡糖> <糖浆> Column:Shodex SUGAR KS-804 Column:Shodex SUGAR KS-802*2 Eluent:H2O Eluent:H2O Flow rate:1.0mL/min Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ Column temp.:80℃ <淀粉水解物> <硫酸软骨素> Column:Shodex SUGAR KS-802*2 Column:Shodex SUGAR KS-G+KS-804*2 Eluent:H2O Eluent:0.05M NaCl-H2O Flow rate:1.0mL/min Flow rate:0.7mL/min Detector: Shodex RI Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ Column temp.:80℃ <糖原> Column:Shodex SUGAR KS-806 Eluent:0.05M NaNO3-H2O Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ 33 —:未检出, *:与溶剂峰重叠 Column:Shodex SUGAR SP0810, SC1011,KS-801 Eluent:H2O Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:80℃ Column:Shodex SUGAR SC1211 Eluent:CH3CN/H2O=35/65 Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:70℃ Column:Shodex SUGAR SZ5532 Eluent:CH3CN/H2O=75/25 Flow rate:1.0mL/min Detector: Shodex RI Column temp.:60℃ 34 http://www.shodexchina.com/ Shodex 主页上介绍了各产品的规格、应用数据以及 HPLC 发生故障时的处理 方法等,详情请参考我们的主页. 昭和电工科学仪器(上海)有限公司 上海市静安区石门一路 211 号旺旺大厦 18F 邮编:200241 电话:021-6217-6111 传真:021-6217-9879 销售邮箱:sales@shodexchina.com 技术支持:support@shodexchina.com 公司网站:www.shodexchina.com Shodex 主页 [注意] 1. 请在使用前仔细阅读产品附带的操作手册. 2. 由于产品的升级换代,某些规格会有变化,恕不另行通知. 3. 本产品目录中的数字仅作参考之用,并不是保证值. 4. 如果操作手册中没有安全方面的内容,处理试剂和其他化学 品时请务必按相关规定小心谨慎. 5. 本手册中所述产品不能用于临床实践.