www.wjgnet.com wcjd@wjgnet.com 世界华人消化杂志 2007年11月8日; 15(31): 3284-3288 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 基础研究 BASIC RESEARCH HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列 分析 韩明阳, 吴爱国, 郭爱林, 李鹏, 纪术峰, 刘铮韩明阳, 吴爱国, 李鹏, 纪术峰, 南方医科大学珠江医院普通 外科 广东省广州市 510280 郭爱林, 广东省人民医院医学研究中心 广东省广州市 510080 刘铮, 南方医科大学病理生理实验室 广东省广州市 510515 韩明阳, 南方医科大学珠江医院普通外科硕士生, 主要从事大肠 癌的RNA干扰研究. 广东省科技计划项目, No. 2005B31201011 通讯作者: 吴爱国, 510280, 广东省广州市工业大道中253号, 南 方医科大学珠江医院普通外科. yang07641@126.com 收稿日期: 2007-06-15 修回日期: 2007-09-13 Cloning of recombinant plasmid affecting HER-2 in gene translation by RNA interference Ming-Yang Han, Ai-Guo Wu, Ai-Lin Guo, Peng Li, Shu-Feng Ji, Zheng Liu Ming-Yang Han, Ai-Guo Wu, Peng Li, Shu-Feng Ji, Department of Surgery, Zhujiang Hospital, Nanfang Medi- cal University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China Ai-Lin Guo, Medical Research Center, Guangdong Pro- vincial People's Hospital, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China Zheng Liu, Pathophysiology and Key Laboratory, Nan- fang Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China Supported by: Science and Technique Program of Guang- dong Province, No. 2005B31201011 Correspondence to: Ai-Guo Wu, Department of Surgery, Zhujiang Hospital, Nanfang Medical University, 253 In- dustrial Road, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China. yang07641@126.com Received: 2007-06-15 Revised: 2007-09-13 Abstract AIM: To clone the recombinant plasmid affecting HER-2 gene translation by RNA interference, and to analyze the nucleic acid sequence of the recombinant plasmid for tumor gene therapy. METHODS: Two DNA sequences containing a small hairpin structure were designed and syn- thesized. The complement form was obtained by annealing and cloning into vector pGPU6/GFP/ Neo, and the recombinant plasmid was trans- formed into strain DH5α. The plasmid identified by restriction enzyme analysis was used for se- quencing. Human colon cancer HT29 cells were transfected with plasmid vector, and then fluo- rescence photographs were taken and selected according to G418. RESULTS: The recombinant plasmid was cloned, and the sequence was obtained. CONCLUSION: Successful cloning of the recom- binant plasmid may help to discover new gene therapies for tumors. Key Words: Human epiclermal-growth-factor recep- tor-2 gene; RNA interfering; Recombinant plasmid; Short hairpin RNA Han MY, Wu AG, Guo AL, Li P, Ji SF, Liu Z. Cloning of recombinant plasmid affecting HER-2 in gene translation by RNA interference. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(31): 3284-3288 摘要 目的: 利用RNA干扰(RNAi)技术, 以HER-2为 靶基因, 设计构建重组表达载体, 并进行测序 鉴定. 方法: 设计具有短发夹结构的两条DNA序列, 经退火成互补双链, 再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体, 转化DH5α菌株, 提取质粒行酶切鉴定后, 并进行序列测定. 再转染人大肠癌HT29细胞, 进行荧光摄像和 G418抗性筛选. 结果: 将合成的DNA序列退火后克隆到载体 上, 经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论: HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的 构建成功, 并可以进行稳定筛选. 关键词: HER-2基因; RNA干扰; 重组表达载体; 短 发夹RNA 韩明阳, 吴爱国, 郭爱林, 李鹏, 纪术峰, 刘铮. HER-2基因靶向 RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析.? 世界华人消化杂志 2007;15(31):3284-3288 http://www.wjgnet.com/1009-3079/15/3284.asp ? 背景资料 HER-2分子是表 皮生长因子受体 家族的第2位成员, 对细胞的生 长、分化及存活 起重要的调节作 用. HER-2在结直 肠癌中阳性表达 与肿瘤浸润转移 密切相关, 在大肠 癌中其过表达与 否是患者预后的 重要指标. 研究表 明他与表皮生长 因子受体家族其 他3位成员形成异 二聚体, 通过多种 信号转导途径促 进肿瘤的增殖、 转移、耐药性的 产生, 是肿瘤基因 治疗的重要靶位 点. 韩明阳, 等. HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析 3285 www.wjgnet.com 0 引言 HER-2(human epidermal-growth-factor recptor 2 ) 分子是表皮生长因子受体家族(humanepidermal-growth-factor recptor)的第2位成员, 对 细胞的生长、分化及存活起重要的调节作用. HER-2在结直肠癌中阳性表达与肿瘤浸润转移 密切相关, 在大肠癌中其过表达与否是患者预 后的重要指标[1-2] . 研究表明他与表皮生长因子 受体家族其他3位成员形成异二聚体, 通过多种 信号转导途径促进肿瘤的增殖、转移、耐药性 的产生, 是肿瘤基因治疗的重要靶位点[3] . 自从RNA干扰技术被《Science》杂志评选 为2002年度世界十大科学成就之首以来, RNA 干扰在结直肠癌的应用方面有了长足的进步. 针对细胞信号转导、细胞凋亡、细胞周期调控 分子、端粒酶、细胞因子及其受体基因等不同 位点而设计的小干扰RNA对结肠癌细胞均有明 显的阻抑作用[4-5] . RNAi技术具有特异性和高效 性, 已经成为研究基因功能的重要工具[6] . RNAi 技术是通过导入细胞19 nt-23 nt的小分子干扰 RNA(small interference RNA, siRNA), 降解同源 mRNA, 高效、特异性阻断目的基因表达[7] . 但是, 裸siRNA导入机体和细胞, 转染效率低, 抑 制时间短. 有研究表明, 短发卡状RNA(short hairpin RNA, shRNA)对靶基因的抑制效果优于 siRNA[8] . 我们构建了针对HER-2基因的短发夹 结构RNA(short hairpin RNA, shRNA)重组表达 载体[9] , 期望通过重组表达载体有效感染和表达 HER-2-shRNA发挥RNAi作用. 1 材料和方法 1.1 材料 含有人U6启动子的pGPU6/GFP/Neo 质粒购买于上海吉玛公司, 克隆用大肠杆菌 D H5α购买于大连宝生物公司, 限制性内切 酶(Bam HⅠ, Pst Ⅰ, Bbs Ⅰ)及T4 DNA连接 酶购买于美国NEB公司, 核酸分子质量标准 Lambda DNA/Eco 130Ⅰ购买于Fermentas公司, 质粒小量抽提试剂盒为天为时代公司产 品, 胶回收试剂盒购买于广州美津生物公司, H T29细胞由广东省人民医院中心实验室赠 送, DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃ 备用. 根据GenBank中报道的HER-2基因核 苷酸序列(No. M11730), 参考shRNA设计原 则进行设计, 使用BLAST将选定的序列和相 应的人基因组数据库进行比较, 排除和其他 编码序列/EST同源的序列. 最后选择出两条 片段作为H E R-2基因干扰片段, 一条是位于 395-415 bp的GCTACGTGCTCATCGCTCACA, 另一条是位于2184-2204 bp的序列GCAGC AGAAGATCCGGAAGTA. loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号. 反义片段 以后接TTTTTT, 以终止转录. 正义链模板的5'端 添加了CACC, 与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补; 反义链模板的5'端添加了GATC, 与Bam HⅠ酶 切后形成的黏端互补; 并将其送上海生工公司 合成. shRNA1正义链: 5'CACCGCTACGTGCT CATCGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCGAT GAGCACGTAGCTTTTTTG3'. shRNA1反义链: 5'CGATGCACGAGTAGCGAGTGTAAGTTCTC TACACTCGCTACTCGTGCATCGAAAAAACC TAG3'. shRNA2正义链: 5'CACC GCAGCAGAA GATCCGGAAGTATTCAAGAGATACTTCCGG ATCTTCTGCTGC TTTTTTG3'. shRNA2反义链: 5'CGTCGTCTTCTAGGCCTTCATAAGTTCTCT ATGAAGGCCTAGAAGAGGACGAAAAAACC TAG3'. 1.2 方法 pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体的构 建. 将DNA Oligo分别用TE(pH8.0)溶解, 浓度为 100 μmol/L. 取相应的正义链和反义链Oligo溶液, 退火体系: 50 μL = 5 μL(正义链)+5 μL(反义 链)+5 μL退火Buffer+35 μL无菌水, 在PCR仪上 按照如下程序进行退火处理: 95℃ 5 min, 85℃ 5 min, 75℃ 5 min, 70℃ 5 min, 4℃保存. 退火处 理后得到浓度为10 μmol的shRNA模板. 将所得 模板溶液稀释500倍, 终浓度为20 nmol/L, 用于 连接反应. 载体pGPU6/GFP/Neo经Bam HⅠ和BbsⅠ双酶切, 琼脂糖电泳, 使用胶回收试剂盒 回收. 将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比 3∶1的比例进行连接反应, 置16℃过夜. 将连 接产物分别接种于100 μL的DH5α感受态细胞 中进行转化, 涂布于含Kanamycin抗性(终浓度 为20 mg/L)的LB平板上, 37℃恒温箱培养过夜. 从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于 3 mL含Kanar抗性(终浓度为20 mg/L)的LB培养 液中, 37℃恒温摇床培养过夜. 用质粒小量抽提 试剂盒小量提取质粒后, 分别用限制性内切酶 Pst Ⅰ和Bam HⅠ做单酶切鉴定, 得到的重组质 粒分别命名pGPU6/GFP/Neo-shRNA1, pGPU6/ GFP/Neo-shRNA2. 将鉴定证实后的两个重组质 粒各取1管菌液送上海英骏公司测序. 所用引物 为5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'. 以含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基培养人大肠 相关报道 2004年Yang et al 应用逆转录病毒 载体介导siRNA 引起乳腺癌和卵 巢癌HER2/neu沉默,导致G0/G1期细 胞增加, 认为其与 细胞周期蛋白D1 降低、p27增加有 关,与下游信号分 子PI3K、pAKt表 达降低有关. www.wjgnet.com 3286 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2007年11月8日第15卷第31期癌HT29细胞株, 胰酶消化传代. 细胞铺6孔板, 用Opti-MEM? Ⅰ无血清培养基(购自Invitrogen公司), 分别以250 μL稀释4 μg质粒载体和10 μL脂 质体Lipofectamine? 2000进行转染, 6-7 h后更换 完全培养基. 转染后的细胞加入600 mg/L G418 筛选, 经14 d后形成阳性克隆, 扩增培养备用. 2 结果 2.1 单酶切鉴定重组质粒 将合成的shDNA序列片 段连入质粒pGPU6/GFP/Neo(图1)后, 用BamHⅠ和PstⅠ内切酶分别单酶切, 质粒pGPU6/GFP/Neo 的BamHⅠ和BbsⅠ酶切位点之间是PstⅠ的酶切 位点. 而插入目的基因片段之后, PstⅠ酶切位点 被取代, 故不能被PstⅠ所酶切.PstⅠ酶切结果显 示有2条带, 第1条为超螺旋的SC构型, 第2条为 质粒的松弛开环的OC构型, 可显示重组体不能 被PstⅠ所酶切. 重组体被BamHⅠ单酶切而线性 化, 条带在5100 bp左右(图2). 2.2 重组质粒测序鉴定 2个重组质粒shRNA编码 序列与设计的片段完全一致, 表明载体构建正 确(图3). 2.3 成功转染和稳定筛选重组质粒 编码shRNA 的带绿色荧光蛋白的重组载体转染入HT29细胞 后在绿色荧光激发波长下细胞应显示为绿色(图4), 转染后24 h荧光显微镜摄片证实转染成功, G418稳定筛选出阳性克隆. 3 讨论 目前在研究哺乳动物细胞的基因功能方面, 产生RNAi效应主要应用的方法有两类: 一类为 体外转录或化学合成siRNA经脂质体或逆转录 病毒载体等转染细胞后介导RNAi, 另一类为发 夹式siRNA表达载体转染细胞后表达的发夹式 siRNAs诱导RNAi. 化学合成的siRNAs抑制作 用时间短, 合成成本昂贵, 并且易于污染RNA 酶而降解, 因此限制其应用. 而发夹式siRNAs 表达载体转染细胞后表达发夹式siRNAs成本 较低, 可以在细胞内RNA酶的作用下被切割 成与体外合成的siRNA相同的序列与结构, 诱导RNAi. 同时, 他可以稳定持续地表达发夹式 siRNA, 使RNAi作用时间更长、更稳定[10-11] . Brummelkamp et al[8] 研究发现将表达载体导入 细胞内在U6启动子的作用下转录产生shRNA, 其发卡环结构被切除后产生siRNA, 具有表达 量多、持续时间久的优点, 并且还证实以9个核 苷酸序列环为发卡的shRNA产生的抑制效应最 强[12] . Willmore et al[13] 应用免疫组化法检测结直 肠良恶性病变erbB-2表达水平. 结果显示, HER-2 基因表达与Duke分期、生存期有关, HER-2表达 强阳性者术后较早发生肝转移, HER-2表达水平 是影响预后的独立因素. 目前HER-2/neu蛋白产 物P185neu所引起的肿瘤细胞内在的对化疗药物 耐药的机制仍不清楚. Pietras et al[14-15] 研究提示 P185neu过表达的肿瘤细胞对损伤的修复能力增 强, 是HER-2/neu诱导化疗药物耐药性的关键. 如 能设法阻断癌细胞内HER-2基因的表达, 定会大 大减弱癌细胞增殖能力同时减弱凋亡抑制. 阐明 HER-2基因在肿瘤细胞凋亡抑制和增殖中的作 用, 可为肿瘤治疗提供新的靶点, 具有重要的理 论意义和实际应用前景[16] . RNAi作为一种高效的序列特异性基因敲 除技术在恶性肿瘤基因治疗领域发展必定更 加迅速. 如今RNA干扰已经成为药物开发的一 种关键技术. 2004年, RNAi首次作为评估药物 靶标的一种技术进入应用, RNAi开发药物也 将会进入临床试验. siRNA技术对于药物发展 的一个主要优点是可以在最短的时间, 以相对 较小的经济发展代价来为任何一个目的基因 设计一个特异siRNA复合物, 同其他传统的小 创新盘点 本文中构建了HER-2siRNA载体, 并建立了稳定 转染细胞株, 为进 一步研究HER-2 基因在大肠癌中 的作用以及探索 大肠癌的基因治 疗奠定基础. Pcmv IE Kanamycin/Neomycin pUC ori GFP SV40 polyA T3 promoter BamHⅠ(1663) BbsⅠ(1720) hU6 promoter T7 promoter f1 ori SV40 promoter HSV TK polyA 图? 1? pGPU6/GFP/Neo质粒载体图谱. 19329 7743 6223 4254 3472 2690 1882 1489 925 421 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 图? 2? 质粒重组载体的酶切鉴定. M: Lamda/Eco130Ⅰ; 左1-3: pshRNA1 PstⅠ酶切; 4-6: pshRNA2 PstⅠ酶切; 右1-3: pshRNA1 BamHⅠ酶切; 4-6: pshRNA2 BamHⅠ酶切. www.wjgnet.com 韩明阳, 等. HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析 3287 分子为基础的治疗相比有明显的灵活性[17] . 质粒pGPU6/GFP/Neo包括一种人U6 RNA聚合酶 Ⅲ启动子, 利用相对单一的启动子和终止序列 产生大量的小RNA. 同时, 位于启动子下游的 shRNA是为了在RNAi质粒进入宿主表达后, 单 链的RNA配对形成短的dsRNA, 引发RNA干扰. 而且, 该载体中含有可供筛选的卡那耐药基 因, 利于阳性重组子的克隆筛选. 在本实验所 构建的载体含有GFP基因, 在细胞内, GFP基因 的表达产物-绿色荧光蛋白, 可以方便地通过荧 光显微镜或流式细胞仪检测, 确定载体转染效 率. 因此, 我们根据GenBank中报道的HER-2基 因核苷酸序列, 参考shRNA设计原则设计出了 两条阻断HER-2基因表达的RNAi序列, 并成功 克隆至载体pGPU6/GFP/Neo, 通过抗性辅助筛 选, 重组体被整合到宿主细胞基因组后, RNA 干扰(RNAi)效应可以实现传代[18] . 为下一步检 测其对HER-2mRNA的抑制效率和抑制HER-2 蛋白表达情况[19] , 进一步研究HER-2基因在大 肠癌中的作用以及探索大肠癌的基因治疗奠定 基础. 4 参考文献 1 Zhao J, Zhang LH, Jia LT, Zhang L, Xu YM, Wang Z, Yu CJ, Peng WD, Wen WH, Wang CJ, Chen SY, Yang AG. Secreted antibody/granzyme B fusion protein stimulates selective killing of HER2- overexpressing tumor cells. J Biol Chem 2004; 279: 21343-21348 2 李巍, 田素礼, 李季. 癌基因C-erbB-2在结直肠癌中的 表达及其与浸润转移的相关性. 世界华人消化杂志 2006; 14: 3206-3211 3 Faltus T, Yuan J, Zimmer B, Kramer A, Loibl S, Kaufmann M, Strebhardt K. Silencing of the HER2/ neu gene by siRNA inhibits proliferation and induces apoptosis in HER2/neu-overexpressing breast cancer cells. Neoplasia 2004; 6: 786-795 4 靳西凤, 冉志华. RNA干扰技术与结肠癌. 世界华人消 化杂志 2006; 14: 2003-2008 5 Perrimon N, Mathey-Prevot B. Applications of high- throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics 2007; 175: 7-16 6 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured 应用要点 本文利用带有绿色荧光蛋白的质粒构建靶向HER-2基因的 shRNA表达载体, 不仅可以检测转 染效率, 也可以为 进一步体外和体 内实验, 探索抑制 HER-2表达在大 肠癌治疗中的作 用奠定基础. 图?4?重组质粒转染HT29细胞后 绿色荧光蛋白的表达(*100).A:pGPU6/GFP/Neo -shRNA1; B: pGPU6/GFP/Neo- shRNA2. A B AAGGACGAAACACCGCTACGTGCTCATCGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCGATGAGCACGTAGCTTTTTTGGATCCACTAGTTC 250 260 270 280 290 300 310 320 GAAACACCGCAGCAGAAGATCCGGAAGTATTCAAGAGATACTTCCGGATCTTCTGCTGCTTTTTTGGATCCACTACTTCTAGAGCGGC 250 260 270 280 290 300 310 320 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2-1 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2-2 图? 3? 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA1, pGPU6/GFP/Neo-shRNA2测序鉴定. www.wjgnet.com 3288 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2007年11月8日第15卷第31期mammalian cells. Nature 2001; 411: 494-498 7 Hannon GJ. RNA interference. Nature 2002; 418: 244-251 8 Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 2002; 296: 550-553 9 刘明社, 王兰, 赵中夫, 张国英, 张芸, 封江南. 干扰Fas 受体表达的串联shRNA表达载体的构建. 世界华人消 化杂志 2006; 14: 2174-2179 10 Paul CP, Good PD, Winer I, Engelke DR. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol 2002; 20: 505-508 11 Wadhwa R, Kaul SC, Miyagishi M, Taira K. 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www.wjgnet.com wcjd@wjgnet.com 世界华人消化杂志 2007年11月8日; 15(31): 3284-3288 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 基础研究 BASIC RESEARCH HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列 分析 韩明阳, 吴爱国, 郭爱林, 李鹏, 纪术峰, 刘铮韩明阳, 吴爱国, 李鹏, 纪术峰, 南方医科大学珠江医院普通 外科 广东省广州市 510280 郭爱林, 广东省人民医院医学研究中心 广东省广州市 510080 刘铮, 南方医科大学病理生理实验室 广东省广州市 510515 韩明阳, 南方医科大学珠江医院普通外科硕士生, 主要从事大肠 癌的RNA干扰研究. 广东省科技计划项目, No. 2005B31201011 通讯作者: 吴爱国, 510280, 广东省广州市工业大道中253号, 南 方医科大学珠江医院普通外科. yang07641@126.com 收稿日期: 2007-06-15 修回日期: 2007-09-13 Cloning of recombinant plasmid affecting HER-2 in gene translation by RNA interference Ming-Yang Han, Ai-Guo Wu, Ai-Lin Guo, Peng Li, Shu-Feng Ji, Zheng Liu Ming-Yang Han, Ai-Guo Wu, Peng Li, Shu-Feng Ji, Department of Surgery, Zhujiang Hospital, Nanfang Medi- cal University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China Ai-Lin Guo, Medical Research Center, Guangdong Pro- vincial People's Hospital, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China Zheng Liu, Pathophysiology and Key Laboratory, Nan- fang Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China Supported by: Science and Technique Program of Guang- dong Province, No. 2005B31201011 Correspondence to: Ai-Guo Wu, Department of Surgery, Zhujiang Hospital, Nanfang Medical University, 253 In- dustrial Road, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China. yang07641@126.com Received: 2007-06-15 Revised: 2007-09-13 Abstract AIM: To clone the recombinant plasmid affecting HER-2 gene translation by RNA interference, and to analyze the nucleic acid sequence of the recombinant plasmid for tumor gene therapy. METHODS: Two DNA sequences containing a small hairpin structure were designed and syn- thesized. The complement form was obtained by annealing and cloning into vector pGPU6/GFP/ Neo, and the recombinant plasmid was trans- formed into strain DH5α. The plasmid identified by restriction enzyme analysis was used for se- quencing. Human colon cancer HT29 cells were transfected with plasmid vector, and then fluo- rescence photographs were taken and selected according to G418. RESULTS: The recombinant plasmid was cloned, and the sequence was obtained. CONCLUSION: Successful cloning of the recom- binant plasmid may help to discover new gene therapies for tumors. Key Words: Human epiclermal-growth-factor recep- tor-2 gene; RNA interfering; Recombinant plasmid; Short hairpin RNA Han MY, Wu AG, Guo AL, Li P, Ji SF, Liu Z. Cloning of recombinant plasmid affecting HER-2 in gene translation by RNA interference. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(31): 3284-3288 摘要 目的: 利用RNA干扰(RNAi)技术, 以HER-2为 靶基因, 设计构建重组表达载体, 并进行测序 鉴定. 方法: 设计具有短发夹结构的两条DNA序列, 经退火成互补双链, 再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体, 转化DH5α菌株, 提取质粒行酶切鉴定后, 并进行序列测定. 再转染人大肠癌HT29细胞, 进行荧光摄像和 G418抗性筛选. 结果: 将合成的DNA序列退火后克隆到载体 上, 经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论: HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的 构建成功, 并可以进行稳定筛选. 关键词: HER-2基因; RNA干扰; 重组表达载体; 短 发夹RNA 韩明阳, 吴爱国, 郭爱林, 李鹏, 纪术峰, 刘铮. HER-2基因靶向 RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析.? 世界华人消化杂志 2007;15(31):3284-3288 http://www.wjgnet.com/1009-3079/15/3284.asp ? 背景资料 HER-2分子是表 皮生长因子受体 家族的第2位成员, 对细胞的生 长、分化及存活 起重要的调节作 用. HER-2在结直 肠癌中阳性表达 与肿瘤浸润转移 密切相关, 在大肠 癌中其过表达与 否是患者预后的 重要指标. 研究表 明他与表皮生长 因子受体家族其 他3位成员形成异 二聚体, 通过多种 信号转导途径促 进肿瘤的增殖、 转移、耐药性的 产生, 是肿瘤基因 治疗的重要靶位 点. 韩明阳, 等. HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析 3285 www.wjgnet.com 0 引言 HER-2(human epidermal-growth-factor recptor 2 ) 分子是表皮生长因子受体家族(humanepidermal-growth-factor recptor)的第2位成员, 对 细胞的生长、分化及存活起重要的调节作用. HER-2在结直肠癌中阳性表达与肿瘤浸润转移 密切相关, 在大肠癌中其过表达与否是患者预 后的重要指标[1-2] . 研究表明他与表皮生长因子 受体家族其他3位成员形成异二聚体, 通过多种 信号转导途径促进肿瘤的增殖、转移、耐药性 的产生, 是肿瘤基因治疗的重要靶位点[3] . 自从RNA干扰技术被《Science》杂志评选 为2002年度世界十大科学成就之首以来, RNA 干扰在结直肠癌的应用方面有了长足的进步. 针对细胞信号转导、细胞凋亡、细胞周期调控 分子、端粒酶、细胞因子及其受体基因等不同 位点而设计的小干扰RNA对结肠癌细胞均有明 显的阻抑作用[4-5] . RNAi技术具有特异性和高效 性, 已经成为研究基因功能的重要工具[6] . RNAi 技术是通过导入细胞19 nt-23 nt的小分子干扰 RNA(small interference RNA, siRNA), 降解同源 mRNA, 高效、特异性阻断目的基因表达[7] . 但是, 裸siRNA导入机体和细胞, 转染效率低, 抑 制时间短. 有研究表明, 短发卡状RNA(short hairpin RNA, shRNA)对靶基因的抑制效果优于 siRNA[8] . 我们构建了针对HER-2基因的短发夹 结构RNA(short hairpin RNA, shRNA)重组表达 载体[9] , 期望通过重组表达载体有效感染和表达 HER-2-shRNA发挥RNAi作用. 1 材料和方法 1.1 材料 含有人U6启动子的pGPU6/GFP/Neo 质粒购买于上海吉玛公司, 克隆用大肠杆菌 D H5α购买于大连宝生物公司, 限制性内切 酶(Bam HⅠ, Pst Ⅰ, Bbs Ⅰ)及T4 DNA连接 酶购买于美国NEB公司, 核酸分子质量标准 Lambda DNA/Eco 130Ⅰ购买于Fermentas公司, 质粒小量抽提试剂盒为天为时代公司产 品, 胶回收试剂盒购买于广州美津生物公司, H T29细胞由广东省人民医院中心实验室赠 送, DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃ 备用. 根据GenBank中报道的HER-2基因核 苷酸序列(No. M11730), 参考shRNA设计原 则进行设计, 使用BLAST将选定的序列和相 应的人基因组数据库进行比较, 排除和其他 编码序列/EST同源的序列. 最后选择出两条 片段作为H E R-2基因干扰片段, 一条是位于 395-415 bp的GCTACGTGCTCATCGCTCACA, 另一条是位于2184-2204 bp的序列GCAGC AGAAGATCCGGAAGTA. loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号. 反义片段 以后接TTTTTT, 以终止转录. 正义链模板的5'端 添加了CACC, 与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补; 反义链模板的5'端添加了GATC, 与Bam HⅠ酶 切后形成的黏端互补; 并将其送上海生工公司 合成. shRNA1正义链: 5'CACCGCTACGTGCT CATCGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCGAT GAGCACGTAGCTTTTTTG3'. shRNA1反义链: 5'CGATGCACGAGTAGCGAGTGTAAGTTCTC TACACTCGCTACTCGTGCATCGAAAAAACC TAG3'. shRNA2正义链: 5'CACC GCAGCAGAA GATCCGGAAGTATTCAAGAGATACTTCCGG ATCTTCTGCTGC TTTTTTG3'. shRNA2反义链: 5'CGTCGTCTTCTAGGCCTTCATAAGTTCTCT ATGAAGGCCTAGAAGAGGACGAAAAAACC TAG3'. 1.2 方法 pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体的构 建. 将DNA Oligo分别用TE(pH8.0)溶解, 浓度为 100 μmol/L. 取相应的正义链和反义链Oligo溶液, 退火体系: 50 μL = 5 μL(正义链)+5 μL(反义 链)+5 μL退火Buffer+35 μL无菌水, 在PCR仪上 按照如下程序进行退火处理: 95℃ 5 min, 85℃ 5 min, 75℃ 5 min, 70℃ 5 min, 4℃保存. 退火处 理后得到浓度为10 μmol的shRNA模板. 将所得 模板溶液稀释500倍, 终浓度为20 nmol/L, 用于 连接反应. 载体pGPU6/GFP/Neo经Bam HⅠ和BbsⅠ双酶切, 琼脂糖电泳, 使用胶回收试剂盒 回收. 将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比 3∶1的比例进行连接反应, 置16℃过夜. 将连 接产物分别接种于100 μL的DH5α感受态细胞 中进行转化, 涂布于含Kanamycin抗性(终浓度 为20 mg/L)的LB平板上, 37℃恒温箱培养过夜. 从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于 3 mL含Kanar抗性(终浓度为20 mg/L)的LB培养 液中, 37℃恒温摇床培养过夜. 用质粒小量抽提 试剂盒小量提取质粒后, 分别用限制性内切酶 Pst Ⅰ和Bam HⅠ做单酶切鉴定, 得到的重组质 粒分别命名pGPU6/GFP/Neo-shRNA1, pGPU6/ GFP/Neo-shRNA2. 将鉴定证实后的两个重组质 粒各取1管菌液送上海英骏公司测序. 所用引物 为5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'. 以含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基培养人大肠 相关报道 2004年Yang et al 应用逆转录病毒 载体介导siRNA 引起乳腺癌和卵 巢癌HER2/neu沉默,导致G0/G1期细 胞增加, 认为其与 细胞周期蛋白D1 降低、p27增加有 关,与下游信号分 子PI3K、pAKt表 达降低有关. www.wjgnet.com 3286 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2007年11月8日第15卷第31期癌HT29细胞株, 胰酶消化传代. 细胞铺6孔板, 用Opti-MEM? Ⅰ无血清培养基(购自Invitrogen公司), 分别以250 μL稀释4 μg质粒载体和10 μL脂 质体Lipofectamine? 2000进行转染, 6-7 h后更换 完全培养基. 转染后的细胞加入600 mg/L G418 筛选, 经14 d后形成阳性克隆, 扩增培养备用. 2 结果 2.1 单酶切鉴定重组质粒 将合成的shDNA序列片 段连入质粒pGPU6/GFP/Neo(图1)后, 用BamHⅠ和PstⅠ内切酶分别单酶切, 质粒pGPU6/GFP/Neo 的BamHⅠ和BbsⅠ酶切位点之间是PstⅠ的酶切 位点. 而插入目的基因片段之后, PstⅠ酶切位点 被取代, 故不能被PstⅠ所酶切.PstⅠ酶切结果显 示有2条带, 第1条为超螺旋的SC构型, 第2条为 质粒的松弛开环的OC构型, 可显示重组体不能 被PstⅠ所酶切. 重组体被BamHⅠ单酶切而线性 化, 条带在5100 bp左右(图2). 2.2 重组质粒测序鉴定 2个重组质粒shRNA编码 序列与设计的片段完全一致, 表明载体构建正 确(图3). 2.3 成功转染和稳定筛选重组质粒 编码shRNA 的带绿色荧光蛋白的重组载体转染入HT29细胞 后在绿色荧光激发波长下细胞应显示为绿色(图4), 转染后24 h荧光显微镜摄片证实转染成功, G418稳定筛选出阳性克隆. 3 讨论 目前在研究哺乳动物细胞的基因功能方面, 产生RNAi效应主要应用的方法有两类: 一类为 体外转录或化学合成siRNA经脂质体或逆转录 病毒载体等转染细胞后介导RNAi, 另一类为发 夹式siRNA表达载体转染细胞后表达的发夹式 siRNAs诱导RNAi. 化学合成的siRNAs抑制作 用时间短, 合成成本昂贵, 并且易于污染RNA 酶而降解, 因此限制其应用. 而发夹式siRNAs 表达载体转染细胞后表达发夹式siRNAs成本 较低, 可以在细胞内RNA酶的作用下被切割 成与体外合成的siRNA相同的序列与结构, 诱导RNAi. 同时, 他可以稳定持续地表达发夹式 siRNA, 使RNAi作用时间更长、更稳定[10-11] . Brummelkamp et al[8] 研究发现将表达载体导入 细胞内在U6启动子的作用下转录产生shRNA, 其发卡环结构被切除后产生siRNA, 具有表达 量多、持续时间久的优点, 并且还证实以9个核 苷酸序列环为发卡的shRNA产生的抑制效应最 强[12] . Willmore et al[13] 应用免疫组化法检测结直 肠良恶性病变erbB-2表达水平. 结果显示, HER-2 基因表达与Duke分期、生存期有关, HER-2表达 强阳性者术后较早发生肝转移, HER-2表达水平 是影响预后的独立因素. 目前HER-2/neu蛋白产 物P185neu所引起的肿瘤细胞内在的对化疗药物 耐药的机制仍不清楚. Pietras et al[14-15] 研究提示 P185neu过表达的肿瘤细胞对损伤的修复能力增 强, 是HER-2/neu诱导化疗药物耐药性的关键. 如 能设法阻断癌细胞内HER-2基因的表达, 定会大 大减弱癌细胞增殖能力同时减弱凋亡抑制. 阐明 HER-2基因在肿瘤细胞凋亡抑制和增殖中的作 用, 可为肿瘤治疗提供新的靶点, 具有重要的理 论意义和实际应用前景[16] . RNAi作为一种高效的序列特异性基因敲 除技术在恶性肿瘤基因治疗领域发展必定更 加迅速. 如今RNA干扰已经成为药物开发的一 种关键技术. 2004年, RNAi首次作为评估药物 靶标的一种技术进入应用, RNAi开发药物也 将会进入临床试验. siRNA技术对于药物发展 的一个主要优点是可以在最短的时间, 以相对 较小的经济发展代价来为任何一个目的基因 设计一个特异siRNA复合物, 同其他传统的小 创新盘点 本文中构建了HER-2siRNA载体, 并建立了稳定 转染细胞株, 为进 一步研究HER-2 基因在大肠癌中 的作用以及探索 大肠癌的基因治 疗奠定基础. Pcmv IE Kanamycin/Neomycin pUC ori GFP SV40 polyA T3 promoter BamHⅠ(1663) BbsⅠ(1720) hU6 promoter T7 promoter f1 ori SV40 promoter HSV TK polyA 图? 1? pGPU6/GFP/Neo质粒载体图谱. 19329 7743 6223 4254 3472 2690 1882 1489 925 421 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 图? 2? 质粒重组载体的酶切鉴定. M: Lamda/Eco130Ⅰ; 左1-3: pshRNA1 PstⅠ酶切; 4-6: pshRNA2 PstⅠ酶切; 右1-3: pshRNA1 BamHⅠ酶切; 4-6: pshRNA2 BamHⅠ酶切. www.wjgnet.com 韩明阳, 等. HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析 3287 分子为基础的治疗相比有明显的灵活性[17] . 质粒pGPU6/GFP/Neo包括一种人U6 RNA聚合酶 Ⅲ启动子, 利用相对单一的启动子和终止序列 产生大量的小RNA. 同时, 位于启动子下游的 shRNA是为了在RNAi质粒进入宿主表达后, 单 链的RNA配对形成短的dsRNA, 引发RNA干扰. 而且, 该载体中含有可供筛选的卡那耐药基 因, 利于阳性重组子的克隆筛选. 在本实验所 构建的载体含有GFP基因, 在细胞内, GFP基因 的表达产物-绿色荧光蛋白, 可以方便地通过荧 光显微镜或流式细胞仪检测, 确定载体转染效 率. 因此, 我们根据GenBank中报道的HER-2基 因核苷酸序列, 参考shRNA设计原则设计出了 两条阻断HER-2基因表达的RNAi序列, 并成功 克隆至载体pGPU6/GFP/Neo, 通过抗性辅助筛 选, 重组体被整合到宿主细胞基因组后, RNA 干扰(RNAi)效应可以实现传代[18] . 为下一步检 测其对HER-2mRNA的抑制效率和抑制HER-2 蛋白表达情况[19] , 进一步研究HER-2基因在大 肠癌中的作用以及探索大肠癌的基因治疗奠定 基础. 4 参考文献 1 Zhao J, Zhang LH, Jia LT, Zhang L, Xu YM, Wang Z, Yu CJ, Peng WD, Wen WH, Wang CJ, Chen SY, Yang AG. Secreted antibody/granzyme B fusion protein stimulates selective killing of HER2- overexpressing tumor cells. J Biol Chem 2004; 279: 21343-21348 2 李巍, 田素礼, 李季. 癌基因C-erbB-2在结直肠癌中的 表达及其与浸润转移的相关性. 世界华人消化杂志 2006; 14: 3206-3211 3 Faltus T, Yuan J, Zimmer B, Kramer A, Loibl S, Kaufmann M, Strebhardt K. 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A B AAGGACGAAACACCGCTACGTGCTCATCGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCGATGAGCACGTAGCTTTTTTGGATCCACTAGTTC 250 260 270 280 290 300 310 320 GAAACACCGCAGCAGAAGATCCGGAAGTATTCAAGAGATACTTCCGGATCTTCTGCTGCTTTTTTGGATCCACTACTTCTAGAGCGGC 250 260 270 280 290 300 310 320 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2-1 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2-2 图? 3? 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA1, pGPU6/GFP/Neo-shRNA2测序鉴定. www.wjgnet.com 3288 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2007年11月8日第15卷第31期mammalian cells. Nature 2001; 411: 494-498 7 Hannon GJ. RNA interference. Nature 2002; 418: 244-251 8 Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 2002; 296: 550-553 9 刘明社, 王兰, 赵中夫, 张国英, 张芸, 封江南. 干扰Fas 受体表达的串联shRNA表达载体的构建. 世界华人消 化杂志 2006; 14: 2174-2179 10 Paul CP, Good PD, Winer I, Engelke DR. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol 2002; 20: 505-508 11 Wadhwa R, Kaul SC, Miyagishi M, Taira K. 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