第 22 卷 第 4 期 2009 年 12 月
宁 波 大 学 学 报( 理 工 版 ) JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY ( NSEE )
Vol.22 No.4 Dec. 2009
文章编号:1001-5132(2009)04-0484-06
pH 突变对拟穴青蟹免疫因子的胁迫影响
刘 璐 1, 杨玉娇 1, 王国良 1,2 *
(1.宁波大学 生命科学与生物工程学院, 浙江 宁波 315211; 2.宁波大学 医学院, 浙江 宁波 315211)
摘要: 以拟穴青蟹为材料, 在实验室条件下测定了 pH 6.5,pH 7.0,pH 7.5,pH 8.0,pH 8.5 各梯度 胁迫 0 h, h, h, h, h 时青蟹的血细胞总数(THC), 24 48 72 96 血细胞吞噬能力及血清中溶菌酶(LZM), 超氧化物歧化酶(SOD), 碱性磷酸酶(AKP), 酸性磷酸酶(ACP), 过氧化物酶(POD), 酚氧化酶(PO) 及溶血素等相关免疫因子的活力变化. 结果表明: 长时间胁迫使各免疫指标值下降, 显示可抑制 免疫因子的活性, 其中 THC,LZM 和溶血素活力下降明显. 小幅度(pH 7.05,pH 8.02)突变下短 时间内各项指标值有所上升, 而后下降; 大幅度(pH 6.45,pH 8.44)突变各项指标值显著降低. pH 胁迫 24 h 后对照组的 THC 显著高于其他各组; pH 7.05,pH 6.45,pH 8.02 组的溶血素活力显著 低于对照组; pH 8.44,pH 6.45 组的血细胞吞噬作用和 ACP 活力显著低于对照组. 可见 THC,溶 血素,血细胞吞噬能力,PO 和 POD 可作为 pH 胁迫对拟穴青蟹抗病力影响的重要参考依据. 关键词: 拟穴青蟹; pH 突变; 免疫因子; 胁迫 中图分类号: S968.25 文献标识码: A
拟 穴 青 蟹 (Scylla paramamosain), 简称 青 蟹 , 是浙江沿海地区重要的经济蟹类养殖品种. 然而, 病害或不明原因的死亡严重制约了青蟹养殖持续 健康发展. 众所周知, 水产生物养殖更直接依赖于 水体环境的稳定和优化, 病害及死亡的发生通常 最先由环境因子变化所诱导 , 从而引起养殖生物 应激反应使其免疫抗病能力下降. pH 是易于变化的一种海水生态环境因子, 对 水质和生物有多方面的影响. 极端的 pH 环境可以 造成水生生物血液酸碱平衡紊乱, 使血液离子调 节机制,气体交换和血氧输送等功能丧失, 甚至危 及生物体生存. pH 作为影响虾蟹及贝类存活, 生长 和免疫活性的重要环境因子正日益受到研究者的
收稿日期: 基金项目: 第一作者: *通讯作者:
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重视[2-4]. 曾缓缓等[5]研究表明 pH 胁迫对青蟹溶菌 酶,酚氧化酶,超氧化物歧化酶的活力有影响. 笔 者以青蟹血清中的相关免疫因子为指标, 研究了 pH 突变和时间效应对养殖青蟹免疫水平及其调节 能力的影响, 以期为青蟹养殖提供实验依据.
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材料与方法
1.1 实验动物 拟穴青蟹购于浙江省三门县红旗养殖场, 选 取平均体重为(250±16) g 的健康青蟹置于海水中暂 养, 控制水温 26~28 ℃, 盐度 17.5±1, pH 7.5±0.05, 氨氮浓度小于 0.1 mgL-1, 溶解氧大于 5 mgL-1, 每日
2009-05-16. 宁波大学学报(理工版)网址: http://3xb.nbu.edu.cn 长江学者和创新团队发展计划(IRT0734); 浙江省科技厅重大攻关项目(2005C12038); 浙江省自然科学基金(Y305189). 刘 璐(1984-), 女, 浙江慈溪人, 在读硕士研究生, 主要研究方向: 水产动物病害. E-mail: liulu-jsa@163.com 王国良(1955-), 男, 浙江定海人, 教授, 主要研究方向: 水产动物病害. E-mail: wanggl@nbip.net
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刘
璐, 等: pH 突变对拟穴青蟹免疫因子的胁迫影响
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及时吸去排泄物, 换水 50%, 暂养 5 d 后进行实验. 1.2 实验方法 设置 pH 梯度为 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 用 NaOH 和 HCl 调节至相应 pH 水平. 每天更换水体的 50%. 实际测定各组 pH 值分别为 6.45±0.05, 7.05±0.06, 7.50±0.05, 8.02±0.04, 8.44±0.04. pH 7.5 组放置青蟹 18 只, 其他各组 15 只. 在 0 h, 12 h, 24 h, 4 8 h , 72 h, 96 h 时取样, 每组取样 3 只测定各项指标. 1.3 检测分析方法 1.3.1 血清溶血素的测定 溶血素测定: 参照牟海津等 方法. 溶血活性 单位定义为: 试验条件下 OD540 增加 0.001 为 1 个 溶血活性单位(U). 1.3.2 血细胞密度 参照叶燕玲等 方法, 血清与固定液 1:1 混合, 用血球计数板计数. 1.3.3 血细胞吞噬能力测定 显微镜检测法: 参考陈孝煊等[8]方法, 并做适 当调整. 将 0.5 mL 浓度为 1×107 细胞mL-1 血细胞 悬液与 0.5 mL 浓度为 1×106~1×107 cfumL-1 大肠杆 菌悬液混合, 28 ℃保温 1 h. 加入等量预冷生理盐 水, 离心弃上清液. 沉淀用生理盐水洗涤 2 次. 将 处理后的沉淀悬浮于生理盐水, 置 4 ℃冰箱备检. 样品用甲醇固定, Giemsa 染色, 油镜下观察计 数. 数据处理采用 t 测验. 1.3.4 血清酶活力测定 血清溶菌酶(LZM),超氧化物歧化酶(SOD), 酸性磷酸酶(ACP)与碱性磷酸酶(AKP)活力采用南 京建成生物工程研究所的酶活力测定试剂盒测定. 血清酚氧化酶活力(PO) 以 L-DOPA(Sigma)为 底物, 参考 Smith 等 方法测定. PO 活力定义为试 验条件下 OD490 增加 0.001 为 1 个活性单位. 血清过氧化物酶活力(POD)以 3,3-二氨基联苯 胺四盐酸盐(DAB-4HCl)为底物, 按参考文献[10] 方法测定. POD 活力定义为试验条件下 OD470 增加 0.001 为 1 个活性单位.

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