海水鱼哈维氏弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗的研究
摘 要
海水养殖向高密度,集约化发展的同时,鱼类病害问题日益突出.其中弧菌
是危害海水养殖鱼类最严重的细菌性病原之一,可感染多种鱼类并造成大量死亡.
本研究对海水养殖场斜带石斑鱼分离的致病弧菌进行了分类鉴定,并对其外膜蛋
白Ompk基因进行克隆和大肠杆菌表达,研究重组外膜蛋白Ompk的免疫保护效果.
探索海水鱼致病性弧菌基因工程亚单位疫苗的制备方法,为海水鱼弧菌病的防治
打下基础.
1.哈维氏弧菌的分离与鉴定
从自然发病的斜带石斑鱼中分离到菌株EcGS020802,经回归感染实验证明是
斜带石斑鱼的致病菌,人工感染实验表明对斜带石斑鱼的半数致死剂量LD50为4.0
×104cfu/g鱼体重,常规生理生化鉴定结果显示为弧菌属的种类,为进一步确定
其分类地位,对病原菌EcGS020802的16S rRNA基因部分序列进行了测定,结果
表明病原菌EcGS020802 16S rRNA基因与哈维氏弧菌V.harveyi (AF230934),溶藻
弧菌V.alginolyticus (AF230931),副溶血弧菌V.parahaemolyticus (X74720) 的
16S rRNA基因的同源性分别为99.8%, 99.6%, 99.7%,其间无明显差异.因此
进一步测定了HSP60基因部分序列,结果显示,菌株EcGS020802 HSP60基因与已
知的V.harveyi(AF230934)HSP60基因序列的同源性最高,为95.7%,与
V.alginolyticus,V.parahaemolyticus HSP60基因序列同源性低于90.6%,以HSP60基
因构建的系统进化树表明,菌株EcGS020802与哈维氏弧菌聚类,根据以上结果将
菌株EcGS020802鉴定为哈维氏弧菌Vibrio harveyi.
2.哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk基因的克隆及其序列分析
根据弧菌Ompk基因保守序列,设计并合成引物,以哈维氏弧菌EcGS020802
基因组DNA为模板,PCR扩增到特异性片断,纯化后克隆到T载体.重组子序列
测定表明,所克隆的基因为哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk基因,该基因含有一个801bp
的开放读码框(ORF),编码266个氨基酸.推测的蛋白不含半胱氨酸残基,分子
量为29.936kDa,等电点(pI)为5.39.氨基酸亲水性分析表明N-端20个氨基酸的
疏水性很高,推测为该蛋白的信号肽,故成熟肽由246个氨基酸组成,推算分子
量为28.11kDa,在142至160位氨基酸之间存在一个明显的跨膜区,可能是该蛋
白的主要抗原决定簇.
3.哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk基因的原核表达
由于外膜蛋白Ompk在细菌中含量较少,且提取工艺复杂,因此通过提取的方
法获得大量的纯度较高的外膜蛋白Ompk比较困难,而对外膜蛋白Ompk进行免疫
效果评价需获取大量的外膜蛋白Ompk,为此进行了外膜蛋白Ompk的大肠杆菌重组
表达.采用PCR方法对哈维氏弧菌Ompk基因进行改造,改造后的基因与原核表达
载体pBV220连接,构建大肠杆菌表达质粒pBVOmpk.该质粒转化大肠杆菌后经42
℃诱导表达, SDS-PAGE分析表明,在28kDa处有一条特异的蛋白带, 薄层扫描分
析显示占菌体总蛋白的24.8%.重组蛋白在大肠杆菌中高效表达形成包涵体,包涵
体经初步纯化,复性后的重组外膜蛋白的纯度为79.9%,产量为20.8mg/L培养基.
4.重组外膜蛋白Ompk免疫原性
重组外膜蛋白经弗氏佐剂充分乳化后,免疫新西兰大白兔,制备抗血清,经

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