生化科技研究所微生物与细胞专题讨论
题目:High-Level Rapid Production of Full-Size Monoclonal Antibodies in Plants by a Single-Vector DNA Replicon System 作者: Zhong Huang, Waranyoo Phoolcharoen, Huafang Lai, Khanrat Piensook, Guy Cardineau, Larry Zeitlin, Kevin J. Whaley, Charles J. Arntzen, Hugh S. Mason and Qiang Chen 文章来源:Biotechnology and Bioengineering 106: 9-17, 2010. 演讲人:Hao-Ye Lin 林浩业 R99B22024 指导老师:Ching-Tsan Huang, PhD 黄庆璨 博士 演讲日期:December 20, 2010 演讲地点:The 6th Classroom
摘要
转基因植物(transgenic plants)表现医药用蛋白质(plant-made pharmaceuticals) 具备安全性高,制程简单和成本低廉的优势,但也有产量低和难以同时表现多个 次单元体蛋白质的缺点.为了克服此问题,本研究尝试以双生病毒属豆科黄矮病 毒衍生载体(Bean yellow dwarf virus-derived vector)和病毒复制起始蛋白质 Rep/RepA,在菸草叶中共同表现具两个次单元体的伊波拉病毒外套膜醣蛋白单 株抗体(monoclonal antibody).此抗体经实验证实可以和减毒后的伊波拉病毒专 一性的结合,显示其功能正确.此外,共表现病毒复制起始蛋白 Rep/RepA 会促 进异源蛋白质快速大量产生,产量可达 0.5 mg/g leaf fresh weight,约在四天内便 可侦测到相当高量的单株抗体.本篇研究亦比较多种载体组合对产量的影响,结 果显示将多个基因建构於单一载体的形式即可表现相当高的产量,可进一步简化 生产制程,建立以植物生产多次单元体药用蛋白质的良好表现平台. Keywords: monoclonal antibody; transgenic plants; plant-made pharmaceuticals; viral vector
前言
本研究之重要性 利用转基因植物生产医药用蛋白质具有安全性高,成本低廉和产物功能完 整的优点,例如:酵素,营养素,抗体,疫苗等.其中单株抗体不仅可以应用 在人类或动物的医疗,也已广泛地应用於工业,农牧业等不同领域上,是目前 以植物生产药用蛋白质研究最接近上市阶段的开发标的.本篇研究以豆科黄矮 病毒衍生载体建立一个大量,快速生产多次单元体蛋白质的表现平台.除了应 用在单株抗体上,也可提升生产具多个次单元体的药用蛋白质,例如口服疫 苗,为医药产业现阶段和未来发展的重点.
 前人作过的研究 1989 年科学家首度证实可在转基因植物中生产功能性抗体【4】 ,随后许 多以植物生产异源蛋白质表现平台的研究相继投入开发.前人研究利用单一病 毒载体或是两种不同的重组病毒载体在菸草叶中生产单株抗体【3】 .进一步研 究显示利用双生病毒的复制起始蛋白质,建构可提升异源基因表现量的载体系 统,以促进转基因植物的异源蛋白质产量【1】 . 作者为何要作本研究 作者先前以豆科黄矮病毒衍生载体,配合双生病毒的复制起始蛋白质以农 杆菌转形策略,应用於菸草的基因转殖,可以快速大量地表现 B 型肝炎表面 抗原等相关异源蛋白质【2】 .由於目前在植物中缺乏可同时表现多次单元体蛋 白质的平台,因此作者尝试以先前的载体,建构具有多个次单元体的病毒载 体,希望可以建立一个可生产多次单元体蛋白质的平台. 本研究欲完成之项目 本篇研究除建构豆科黄矮病毒衍生载体以表现多次单元体的目标蛋白 质,并期望简化转形步骤以提升蛋白质产量.因此将病毒复制相关蛋白 Rep/RepA 和目标蛋白质建构於单一载体,希望最终可以达到操作方便,快速 且高产量的转基因植物表现平台,作为多次单元体蛋白质开发的生产策略.
材料与方法
质体建构
本研究中共使用了九个质体,如上图所示. 共表现(co-expression)载体: 1. pREP110 (C1/C2 基因可表现病毒复制起始蛋 白 Rep/RepA); 2. pP19 (P19 基因可表现 post-transcriptional gene silencing
suppressor); 3. pBYGFP (green fluorescent protein); 4. pBYDsRed (red fluorescent protein); 5. pBY-H (6D8); 6. pBY-L (6D8) (分别带有伊波拉病毒单株抗体 heavy chain 和 light chain),各载体前后加上病毒的 LIR ( long intergenic region)和 SIR(short intergenic region). 单一载体表现多基因: 1. pBYGFPDsRed.R (带有绿色和红色报导基因以及 C1/C2); 2. pBY-HL (6D8).R (带有伊波拉病毒单株抗体 heavy chain 和 light chain 以及 C1/C2). 农杆菌媒介转形法 先以电穿孔将载体转入农杆菌 LBA4404,以抗生素 kanamycin 挑选转形株, 经过液态培养,将菌体以 infiltration buffer 润洗后,进农杆菌渗入法 (Agrobacterium infiltration),从菸草叶下层气孔处注入悬浮的菌液,使农杆菌从 气孔处渗入以感染植物细胞 目标基因表现量检定 分别抽取全量 DNA,以 DNA 电泳及南方氏杂合分析,探讨目标基因表现的 情形. 报导蛋白质分析 GFP 和 DsRed 萤光蛋白质表现以萤光显微镜观察. 目标蛋白质分析 在农杆菌感染后的二至八天,分别将成功表现伊波拉病毒单株抗体的菸草 叶以粗萃法取得 total soluble protein,以 ELISA 定量并利用 SDS-PAGE 和 western blot 确认蛋白质大小.利用硫酸铵沉淀法和亲和性层析法纯化目标蛋 白质,将纯化后的单株抗体和减毒后的伊波拉病毒利用 ELISA 测定病原抗体 之专一性,以确认菸草生产的单株抗体功能正确.

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