实验十一_ 荧光抗体染色法

目的要求

1. 通过试验，进一步理解荧光抗体染色法的原理。

2. 以炭疽荚膜荧光抗体染色法为例，掌握荧光抗体染色法的基本操作方法。

操作步骤

原理：免疫球蛋白与荧光素结合后制成的荧光抗体，仍具有与相应抗原结合的抗体特性，又具有在荧光显微镜下易检测的特性，故可做为一种特异性试剂，在特定条件下去浸染标本，若标本中存在着相应的抗原时，抗原可与荧光抗体结合，形成抗原一抗体一荧光素复合物，在荧光显微镜下观察，即可看到发荧光的抗原形态，表明相应抗原的存在。如果标本中不存在与该种荧光抗体相应的抗原，荧光抗体就不能被结合，而被水洗掉，在荧光显微镜下就看不到抗原的形态，从而达到鉴别抗原、诊断疾病的目的。

一、直接法

（一）用疑似病尸的脏器（肝、脾、淋巴结等）涂片,自然干燥，火焰固定。

（二）用滴管将抗炭疽杆菌荚膜荧光抗体诊断液（用PBS稀释至工作效价）滴加于待检标本片上，并使之布满整个标本。

（三）将玻片置湿盒中（玻片少时，可用大平皿，玻片多时，可用放有玻片架的有盖塘瓷盘，容器底部垫以含水纱布或滤纸），放37℃温箱，作用30分钟左右。

（四）取出玻片，用pH7.2～7.6PBS冲去多余的荧光抗体，将玻片在大量的PBS中漂洗15分钟，中间换液一次，再以蒸馏水冲洗除盐。

（五）玻片自然干燥后，放荧光显微镜下，用高倍镜观察，或滴一滴甘油缓冲盐水（中性无自发荧光的甘油9份，加pH7.4～7.6PBS1份）代替香柏油，用油镜观察。

二、间接法

（一）用疑似病尸的脏器涂片，自然干燥,火焰固定。

（二）用滴管吸取未标记的兔抗炭疽杆菌荚膜血清（事先用PBS稀释10～20倍），滴加于待检标本片上，并使其布满整个标本。

（三）将玻片置湿盒中，放37℃温箱，作用30分钟，取出玻片，用PBS冲洗15分钟，中间换液两次。

（四）玻片干燥后，滴加羊抗兔IgG荧光抗体诊断液（以PBS稀释至工作效价），并使它布满整个标本。

（五）置湿盒中，放37℃温箱，作用30分钟，取出玻片，用PBS充分漂洗，再以中性蒸馏水冲洗除盐。

（六）玻片干燥后，放荧光显微镜下观察。

结果判定

用荧光显微镜观察菌体荧光图像，主要以两个指标判定结果：一是菌体的形态特征：二是荧光亮度。疑为炭疽的标本片经用荧光抗体（直接法或间接法）染色后，若标本片上发现增大的有荚膜的大杆菌，荚膜有明亮的黄绿一亮绿色的荧光，荚膜中央菌体呈暗绿色或不着色，则判为阳性；若被检病料有不同程度的分解，镜检时见到呈杆状排列的颗粒状荧光，而菌体不清，亦有一定的判定意义；但发现无荚膜而发均匀荧光的杆菌，则不能判为炭疽杆菌，因抗炭疽杆菌荚膜血清中含有沉淀素，能与部分其它需氧芽胞杆菌发生交叉反应。

初次应用制成的荧光抗体时，应设以下对照：

1．阳性对照_ 用接种炭疽杆菌死亡的小鼠肝脏涂片，用制备的荧光抗体染色，应见到明显增大的粗大杆菌，荚膜有明亮的黄绿一亮绿色荧光，菌体呈暗绿色，并应将制备的荧光抗体用PBS做不同倍数稀释后，分别用以染色，以确定荧光抗体的工作效价（菌体有明亮的荧光）及非特异性荧光最弱的荧光抗体稀释倍数。如制成的荧光抗体浓度太低,染色后荧光太弱，可将其浓缩后再用。

2．类属抗原对照_ 以枯草杆菌或其它类炭疽杆菌的纯培养物涂片，用制备的荧光抗体染色，应无明亮的特异荧光。

3．阻抑试验_ 将制备的荧光抗体与未标记的同类IgG或血清等量混合后，去染已知含炭疽杆菌的病料（一步法）, 或先以未标记的血清处理标本片，作用30分钟后，再加荧光抗体（二步法）染色，均应无荧光，或呈弱荧光。